豬瘟強毒株與兔化弱毒疫苗株的環(huán)介導等溫擴增鑒別檢測

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1、Athesis(dissertation)submittedtoZheng吐ouUniVers塒forthede釅eeofMasterTheDifrerentiationandDetectionofVilmlemand、廠accineStraillsofClassicalSwilleFeVerV．眥sbyLoop-mediatedIsomemalAmplificationAssayByW．enboHeSuperVisor：Pro￡GaipingZhangM旬or：CellBi0109ySchool

2、ofLifeSciencesApril2014學位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學位論文，是本人在導師的指導下，獨立進行研究所取得的成果。除文中已經注明引用的內容外，本論文不包含任何其他個人或集體已經發(fā)表或撰寫過的科研成果。對本文的研做出重要貢獻的個人和集體，均已在文中以明確方式標明。本聲明的法律責任由本人承擔。學位論文作者：／(司之博日期：列懺多月／日學位論文使用授權聲明本人在導師指導下完成的論文及相關的職務作品，知識產權歸屬鄭州大學。根據鄭州大學有關保留、使用學位論文的規(guī)定，同意學校保留

3、或向國家有關部門或機構送交論文的復印件和電子版，允許論文被查閱和借閱；本人授權鄭州大學可以將本學位論文的全部或部分編入有關數據庫迸行檢索，可以采用影印、縮印或者其他復制手段保存論文和匯編本學位論文。本人離校后發(fā)表、使用學位論文或與該學位論文直接相關的學術論文或成果時，第一署名單位仍然為鄭州大學。保密論文在解密后應遵守此規(guī)定。學位論文作者：／f可吏博日期：砷中年／月／日摘要豬瘟(claSsicalswhefever，CSF)是由黃病毒科瘟病毒屬的豬瘟病毒(claSsicalswiIle是vervir

4、us，CSFV)引起的一種重大傳染病，具有很高的死亡率，對我國生豬產業(yè)造成巨大的損害。CSFV是單股正鏈I礬A病毒，基因組大小約為12．3kb，編碼一個大的多聚體蛋白，蛋白酶將其裂解成12種蛋白，包括8種非結構蛋白(尸7、坳，D、Ⅳ蛇、Ⅳ站、刪、腳、刪、腳)和4種結構蛋白(囊膜糖蛋白D凇、衣殼蛋白C、EJ、腳)，其中，5，．∽噥、3，-∽噥、腳基因序列比較保守，而Ⅳ鼯B常用于CSFV基因分型。目前，我國豬瘟的防控主要采用豬瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)免疫，但是由于缺乏相應的血清學標志和配套的鑒別檢測

5、方法，其在我國的大規(guī)模應用，使得通過抗體檢測很難區(qū)分免疫弱毒和野毒感染，不利于豬瘟的凈化。針對豬瘟病毒野毒感染與疫苗免疫鑒別診斷的關鍵問題，本研究參照GellBaIlk中登錄的CSFV標準強毒株(shjmen、A1fort、Brescia等)、疫苗株(HCLv、ChiIleseC、礎mes等)、不同基因亞型的CSFV野毒株以及牛病毒性腹瀉病毒1型(BVDv-1)和牛病毒性腹瀉病毒2型(BVDV-2)的全基因組序列，利用DNAstar軟件系統比較分析豬瘟強弱毒株的序列差異，設計一套分別針對豬瘟弱毒與

6、強毒的特異性環(huán)介導等溫擴增(LAMP)引物，優(yōu)化I，AⅧ反應體系與反應條件，分別建立CSFV強毒株和弱毒疫苗株的L削誑，檢測方法。結果表明65℃恒溫作用50mill即可完成L√6山口擴增，LAMP擴增產物用羅丹明B指示劑肉眼觀察顏色變化，陽性呈黃色，陰性呈橙紅色；用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，陽性擴增有特異性梯形條帶產生。經檢測，豬瘟強毒株的特異性L舢心檢測方法對豬瘟弱毒疫苗及其他豬源病毒均無特異性擴增，豬瘟弱毒疫苗株的L觸v口檢測方法亦如此，特異性良好，同時建立的L觸心檢測方法比RT-PCR靈敏度高

7、出1000倍，且重復性穩(wěn)定性良好。用建立的LAMp方法和ImPCR方法檢測20份豬病料，符合率為90．91％。因此，本實驗建立的豬瘟強毒株與弱毒疫苗株的L肼P檢測技術是一種快速準確，特異性好，靈敏度高，適合基層使用的方法，真正實現了對病原微生物核酸的特異、敏感、高效和快捷檢測，為我國豬瘟防控與凈化提供技術支撐，對動物疫病多重感染的鑒別檢測具有重要意義。關鍵詞：豬瘟強毒株；豬瘟兔化弱毒疫苗株；環(huán)介導等溫擴增；鑒別檢測Abs仃actAbStraCtClaSsicalswille受Ver(CSF)isa

8、地烈yinfectiousdiseaSea髖ct跡gsw逾eandboar，resul血19inseriouseconomic10sses，charaCterizedbyfeVer，hemo玎hage，arldhighmonali妙rates．CSFiscauSedbytllecl弱sicalswiIlefevervims(CSFV)．CSFVisamenlberoft11egenusPPsffvf，．搬，belongingtothe觸ily月口vfl，f，．矗z口P．CSFVis