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《細(xì)胞計(jì)數(shù)方法------細(xì)胞計(jì)數(shù)板法》由會(huì)員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫(kù)。
1、細(xì)胞計(jì)數(shù)方法------細(xì)胞計(jì)數(shù)板法實(shí)驗(yàn)原理:當(dāng)待測(cè)細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時(shí),通過測(cè)定一定體積懸液中的細(xì)胞的數(shù)目,即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。具體操作:1.將計(jì)數(shù)板及蓋片擦拭干凈,并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板。2.將細(xì)胞懸液吸出少許,滴加在蓋片邊緣,使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間,靜置3min,注意蓋片下不要有氣泡,也不能讓懸液流入旁邊槽中。3.計(jì)算板四大格細(xì)胞總數(shù),壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按公式計(jì)算:細(xì)胞數(shù)/mL=四大格細(xì)胞總數(shù)/4×10個(gè)/ml(注:當(dāng)細(xì)胞很多時(shí),可在四個(gè)格中選一定數(shù)目較平均的小格,由于每大格中有
2、16個(gè)小格,然后計(jì)左側(cè)和上方的細(xì)胞數(shù),求出每小格的細(xì)胞數(shù),取平均值m,m×16即每個(gè)格的平均值。所以,細(xì)胞密度=m×16×10個(gè)/ml)說(shuō)明:公式中除以4,因?yàn)橛?jì)數(shù)了4個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)。公式中乘以10因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為:1.0mm(長(zhǎng))×1.0mm(寬)×0.1mm(高)=0.1mm而1ml=1000ul=1000mm(注意:鏡下偶見有兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán),應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算,若細(xì)胞團(tuán)10%以上,說(shuō)明分散不好,需重新制備細(xì)胞懸液。)========================================
3、========細(xì)胞計(jì)數(shù)板的使用一、血球計(jì)數(shù)板-基本構(gòu)造血球計(jì)數(shù)板是一塊特制的厚型載玻片,載玻片上有四個(gè)槽構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)。中間的平臺(tái)較寬,其中間又被一短橫槽分隔成兩半,每個(gè)半邊上面各刻有一小方格網(wǎng),每個(gè)方格網(wǎng)共分九個(gè)大格,中央的一大格作為計(jì)數(shù)用,稱為計(jì)數(shù)區(qū)。計(jì)數(shù)區(qū)的刻度有兩種:一種是計(jì)數(shù)區(qū)分為16個(gè)大方格(大方格用三線隔開),而每個(gè)大方格又分成25個(gè)小方格;另一種是一個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)分成25個(gè)大方格(大方格之間用雙線分開),而每個(gè)大方格又分成16個(gè)小方格。但是不管計(jì)數(shù)區(qū)是哪一種構(gòu)造,它們都有一個(gè)共同特點(diǎn),即計(jì)數(shù)區(qū)都由400個(gè)小方格組
4、成。計(jì)數(shù)區(qū)邊長(zhǎng)為1mm,則計(jì)數(shù)區(qū)的面積為1mm2,每個(gè)小方格的面積為1/400mm2。蓋上蓋玻片后,計(jì)數(shù)區(qū)的高度為0.1mm,所以每個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)的體積為0.1mm3,每個(gè)小方格的體積為1/4000mm3。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí),先要測(cè)定每個(gè)小方格中微生物的數(shù)量,再換算成每毫升菌液(或每克樣品)中微生物細(xì)胞的數(shù)量。二、細(xì)胞計(jì)數(shù)板-使用方法1.視待測(cè)菌懸液濃度,加無(wú)菌水適當(dāng)稀釋(斜面一般稀釋100倍),以每小格的菌數(shù)可數(shù)為度。2.取潔凈的細(xì)胞計(jì)數(shù)板一塊,在計(jì)數(shù)區(qū)上蓋上一塊蓋玻片。3.將菌懸液搖勻,用滴管吸取少許,從計(jì)數(shù)板中間平臺(tái)兩側(cè)
5、的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣摘入一小滴(不宜過多),讓菌懸液利用液體的表面張力充滿計(jì)數(shù)區(qū),勿使氣泡產(chǎn)生,并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸液。也可以將菌懸液直接滴加在計(jì)數(shù)區(qū)上(不要使計(jì)數(shù)區(qū)兩邊平臺(tái)沾上菌懸液,以免加蓋蓋玻片后,造成計(jì)數(shù)區(qū)深度的升高),然后加蓋蓋玻片(勿使產(chǎn)生氣泡)。4.靜置片刻,使細(xì)胞沉降到計(jì)數(shù)板上,不再隨液體漂移。將細(xì)胞計(jì)數(shù)板放置于顯微鏡的載物臺(tái)上夾穩(wěn),先在低倍鏡下找到計(jì)數(shù)區(qū)后,再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察并計(jì)數(shù)。由于生活細(xì)胞的折光率和水的折光率相近,觀察時(shí)應(yīng)減弱光照的強(qiáng)度。5.計(jì)數(shù)時(shí)若計(jì)數(shù)區(qū)是由16個(gè)大方格組成,按對(duì)角
6、線方位,數(shù)左上、左下、右上、右下的4個(gè)大方格(即100小格)的菌數(shù)。如果是25個(gè)大方格組成的計(jì)數(shù)區(qū),除數(shù)上述四個(gè)大方格外,還需數(shù)中央1個(gè)大方格的菌數(shù)(即80個(gè)小格)。為了保證計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性,避免重復(fù)計(jì)數(shù)和漏記,在計(jì)數(shù)時(shí),對(duì)沉降在格線上的細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)應(yīng)有統(tǒng)一的規(guī)定。如菌體位于大方格的雙線上,計(jì)數(shù)時(shí)則數(shù)上線不數(shù)下線,數(shù)左線不數(shù)右線,以減少誤差。即位于本格上線和左線上的細(xì)胞計(jì)入本格,本格的下線和右線上的細(xì)胞按規(guī)定計(jì)入相應(yīng)的格中。見下圖:即本格中計(jì)數(shù)細(xì)胞為3個(gè)。6.對(duì)于出芽的酵母菌,芽體達(dá)到母細(xì)胞大小一半時(shí),即可作為兩個(gè)菌體計(jì)算。每個(gè)
7、樣品重復(fù)計(jì)數(shù)2-3次(每次數(shù)值不應(yīng)相差過大,否則應(yīng)重新操作),按公式計(jì)算出每mL(g)菌懸液所含細(xì)胞數(shù)量。7.測(cè)數(shù)完畢,取下蓋玻片,用水將細(xì)胞計(jì)數(shù)板沖洗干凈,切勿用硬物洗刷或抹擦,以免損壞網(wǎng)格刻度。洗凈后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干,放入盒內(nèi)保存。三、細(xì)胞計(jì)數(shù)板-計(jì)數(shù)公式1、16格×25格的細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算公式:細(xì)胞數(shù)/ml=100小格內(nèi)細(xì)胞個(gè)數(shù)/100×400×10000×稀釋倍數(shù)1、25格×16格的細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算公式:細(xì)胞數(shù)/ml=80小格內(nèi)細(xì)胞個(gè)數(shù)/80×400×10000×稀釋倍數(shù)四、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的誤差主要來(lái)自哪些方面
8、?應(yīng)如何盡量減少誤差,力求準(zhǔn)確?血細(xì)胞計(jì)數(shù)的誤差分別來(lái)源于技術(shù)誤差和固有誤差。其中由于操作人員采血不順利,器材處理、使用不當(dāng),稀釋不準(zhǔn)確,細(xì)胞識(shí)別錯(cuò)誤等因素所造成的誤差屬技術(shù)誤差;而由于儀器(計(jì)數(shù)板、蓋片、吸管等)不夠準(zhǔn)確與精密帶來(lái)的誤差稱儀器誤差,由于細(xì)胞分布不均勻等因素帶來(lái)的細(xì)胞計(jì)數(shù)誤差屬于分布誤差