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《細(xì)胞計數(shù)方法------細(xì)胞計數(shù)板法》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、細(xì)胞計數(shù)方法------細(xì)胞計數(shù)板法實驗原理:當(dāng)待測細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時,通過測定一定體積懸液中的細(xì)胞的數(shù)目,即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。具體操作:1.將計數(shù)板及蓋片擦拭干凈,并將蓋片蓋在計數(shù)板。2.將細(xì)胞懸液吸出少許,滴加在蓋片邊緣,使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間,靜置3min,注意蓋片下不要有氣泡,也不能讓懸液流入旁邊槽中。3.計算板四大格細(xì)胞總數(shù),壓線細(xì)胞只計左側(cè)和上方的。然后按公式計算:細(xì)胞數(shù)/mL=四大格細(xì)胞總數(shù)/4×10個/ml(注:當(dāng)細(xì)胞很多時,可在四個格中選一定數(shù)目較平均的小格
2、,由于每大格中有16個小格,然后計左側(cè)和上方的細(xì)胞數(shù),求出每小格的細(xì)胞數(shù),取平均值m,m×16即每個格的平均值。所以,細(xì)胞密度=m×16×10個/ml)說明:公式中除以4,因為計數(shù)了4個大格的細(xì)胞數(shù)。公式中乘以10因為計數(shù)板中每一個大格的體積為:1.0mm(長)×1.0mm(寬)×0.1mm(高)=0.1mm而1ml=1000ul=1000mm(注意:鏡下偶見有兩個以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán),應(yīng)按單個細(xì)胞計算,若細(xì)胞團(tuán)10%以上,說明分散不好,需重新制備細(xì)胞懸液。)========================
3、========================細(xì)胞計數(shù)板的使用一、血球計數(shù)板-基本構(gòu)造血球計數(shù)板是一塊特制的厚型載玻片,載玻片上有四個槽構(gòu)成三個平臺。中間的平臺較寬,其中間又被一短橫槽分隔成兩半,每個半邊上面各刻有一小方格網(wǎng),每個方格網(wǎng)共分九個大格,中央的一大格作為計數(shù)用,稱為計數(shù)區(qū)。計數(shù)區(qū)的刻度有兩種:一種是計數(shù)區(qū)分為16個大方格(大方格用三線隔開),而每個大方格又分成25個小方格;另一種是一個計數(shù)區(qū)分成25個大方格(大方格之間用雙線分開),而每個大方格又分成16個小方格。但是不管計數(shù)區(qū)是哪一種構(gòu)造,它
4、們都有一個共同特點,即計數(shù)區(qū)都由400個小方格組成。計數(shù)區(qū)邊長為1mm,則計數(shù)區(qū)的面積為1mm2,每個小方格的面積為1/400mm2。蓋上蓋玻片后,計數(shù)區(qū)的高度為0.1mm,所以每個計數(shù)區(qū)的體積為0.1mm3,每個小方格的體積為1/4000mm3。使用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)時,先要測定每個小方格中微生物的數(shù)量,再換算成每毫升菌液(或每克樣品)中微生物細(xì)胞的數(shù)量。二、細(xì)胞計數(shù)板-使用方法1.視待測菌懸液濃度,加無菌水適當(dāng)稀釋(斜面一般稀釋100倍),以每小格的菌數(shù)可數(shù)為度。2.取潔凈的細(xì)胞計數(shù)板一塊,在計數(shù)區(qū)上蓋上一
5、塊蓋玻片。3.將菌懸液搖勻,用滴管吸取少許,從計數(shù)板中間平臺兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣摘入一小滴(不宜過多),讓菌懸液利用液體的表面張力充滿計數(shù)區(qū),勿使氣泡產(chǎn)生,并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸液。也可以將菌懸液直接滴加在計數(shù)區(qū)上(不要使計數(shù)區(qū)兩邊平臺沾上菌懸液,以免加蓋蓋玻片后,造成計數(shù)區(qū)深度的升高),然后加蓋蓋玻片(勿使產(chǎn)生氣泡)。4.靜置片刻,使細(xì)胞沉降到計數(shù)板上,不再隨液體漂移。將細(xì)胞計數(shù)板放置于顯微鏡的載物臺上夾穩(wěn),先在低倍鏡下找到計數(shù)區(qū)后,再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察并計數(shù)。由于生活細(xì)胞的折光率和水的折
6、光率相近,觀察時應(yīng)減弱光照的強(qiáng)度。5.計數(shù)時若計數(shù)區(qū)是由16個大方格組成,按對角線方位,數(shù)左上、左下、右上、右下的4個大方格(即100小格)的菌數(shù)。如果是25個大方格組成的計數(shù)區(qū),除數(shù)上述四個大方格外,還需數(shù)中央1個大方格的菌數(shù)(即80個小格)。為了保證計數(shù)的準(zhǔn)確性,避免重復(fù)計數(shù)和漏記,在計數(shù)時,對沉降在格線上的細(xì)胞的統(tǒng)計應(yīng)有統(tǒng)一的規(guī)定。如菌體位于大方格的雙線上,計數(shù)時則數(shù)上線不數(shù)下線,數(shù)左線不數(shù)右線,以減少誤差。即位于本格上線和左線上的細(xì)胞計入本格,本格的下線和右線上的細(xì)胞按規(guī)定計入相應(yīng)的格中。見下圖:即
7、本格中計數(shù)細(xì)胞為3個。6.對于出芽的酵母菌,芽體達(dá)到母細(xì)胞大小一半時,即可作為兩個菌體計算。每個樣品重復(fù)計數(shù)2-3次(每次數(shù)值不應(yīng)相差過大,否則應(yīng)重新操作),按公式計算出每mL(g)菌懸液所含細(xì)胞數(shù)量。7.測數(shù)完畢,取下蓋玻片,用水將細(xì)胞計數(shù)板沖洗干凈,切勿用硬物洗刷或抹擦,以免損壞網(wǎng)格刻度。洗凈后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干,放入盒內(nèi)保存。三、細(xì)胞計數(shù)板-計數(shù)公式1、16格×25格的細(xì)胞計數(shù)板計算公式:細(xì)胞數(shù)/ml=100小格內(nèi)細(xì)胞個數(shù)/100×400×10000×稀釋倍數(shù)1、25格×16格的細(xì)胞計數(shù)板計算公式
8、:細(xì)胞數(shù)/ml=80小格內(nèi)細(xì)胞個數(shù)/80×400×10000×稀釋倍數(shù)四、血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)的誤差主要來自哪些方面?應(yīng)如何盡量減少誤差,力求準(zhǔn)確?血細(xì)胞計數(shù)的誤差分別來源于技術(shù)誤差和固有誤差。其中由于操作人員采血不順利,器材處理、使用不當(dāng),稀釋不準(zhǔn)確,細(xì)胞識別錯誤等因素所造成的誤差屬技術(shù)誤差;而由于儀器(計數(shù)板、蓋片、吸管等)不夠準(zhǔn)確與精密帶來的誤差稱儀器誤差,由于細(xì)胞分布不均勻等因素帶來的細(xì)胞計數(shù)誤差屬于分布誤差