枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶條件的研究

《枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶條件的研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。

1、枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶條件的研究摘要產(chǎn)堿性蛋白酶枯草芽孢桿菌在前期培養(yǎng)基質(zhì)優(yōu)化的基礎(chǔ)上,采用了分階段溶氧控制策略，在5L發(fā)酵罐中進(jìn)行過程控制,即在0～13h控制溶氧為40%，13～21h控制溶氧為50%，13h后控制溶氧為40%。探索分階段溶氧對枯草芽孢桿菌發(fā)酵過程的影響。利用單因素法對一株枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶的培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化，確定發(fā)酵培養(yǎng)基各成分最適宜配比。最后確定了該菌株的最適發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(g/100mL)：酵母浸粉1.75,麥芽糊精10,檸檬酸鈉0.3,CaCl20.3,Fe2+0.5;最適搖瓶發(fā)酵條件為:菌齡12h,接

2、種量3.5%,裝液量50mL/250mL,搖床轉(zhuǎn)速200r/min,34℃,發(fā)酵54h,堿性蛋白酶的發(fā)酵單位可達(dá)507.53U/mL,比在其他無機(jī)鹽條件下的產(chǎn)量都高。此外,還進(jìn)行了5L罐放大實(shí)驗(yàn),裝液量為3L,在5L罐所確定的最適工藝條件下,發(fā)酵單位可達(dá)520.2u/mL。關(guān)鍵詞：堿性蛋白酶；枯草芽孢桿菌；液體培養(yǎng)基引言　堿性蛋白酶是指在堿性條件下水解蛋白質(zhì)肽鍵的酶類,主要應(yīng)用.于生產(chǎn)加酶洗滌[1],另外,在制革、絲綢、醫(yī)藥、食品、飼料和生物化學(xué)試劑等領(lǐng)域也有應(yīng)用。我國在20世紀(jì)70年代初期就成功開發(fā)了堿性蛋白酶,并實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)[2]。目前,我

3、國用于生產(chǎn)的菌種為國內(nèi)學(xué)者自行篩選誘變的菌株———枯草芽孢桿菌,其發(fā)酵單位在10000u/mL以上,與國外先進(jìn)水平相差甚遠(yuǎn)[3]。本實(shí)驗(yàn)所采用的產(chǎn)堿性蛋白酶菌株為枯草芽孢桿菌,其實(shí)驗(yàn)發(fā)酵單位為22000u/mL,與國外大型酶制劑公司所報(bào)道的生產(chǎn)水平30000u/mL相差較大[4]。本實(shí)驗(yàn)對該菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基利用單因素實(shí)驗(yàn)確定其基本成分，選擇出適合該菌株發(fā)酵的最適培養(yǎng)基，從而使其酶活有一定的增長,為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。1　材料與方法1.1　菌種與培養(yǎng)基1.1.1菌種枯草芽孢桿菌(Baci11ussubti1is)由農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室提

4、供。1.1.2培養(yǎng)基1.1.2.1種子培養(yǎng)基胰蛋白胨5g,酵母浸粉5g,葡萄糖10g,K2HPO410g1.1.2.2發(fā)酵培養(yǎng)基酵母浸粉5g,麥芽糊精20g,檸檬酸鈉3g,CaCl23g,Fe2+0.5g1.2試劑及儀器酪氨酸、福林酚試劑、三氯乙酸、無水碳酸鈉、干酪素、棉籽餅粉、酵母浸粉、麥芽糊精、檸檬酸鈉、CaCl2、K2HPO4、KCl；pH計(jì)、722分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、離心機(jī)。1.3方法1.3.1以無機(jī)鹽為單因素優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基取牛肉膏0.5g、葡萄糖0.5g、用水定溶至150mL，pH值自然。將以上中的培養(yǎng)液分別裝入6個(gè)三角瓶中（各25m

5、L），將FeSO40.02%,Fe2(SO4)30.02%,MgSO4、溶液分別加入到其中5個(gè)三角瓶中并標(biāo)記。滅菌，121℃高壓滅菌20min。接種在已滅菌的六個(gè)三角瓶中接入菌種，放入振蕩培養(yǎng)箱在37℃下培養(yǎng)48h，轉(zhuǎn)速200r/min。在其他條件不變的情況下，以酶活力為指標(biāo)，確定最佳無機(jī)鹽成分。1.3.2堿性蛋白酶活力的測定取培養(yǎng)液于1200r/min離心15min取上清液稀釋至10和50倍，采用福林法測定蛋白酶活力[5]。取試管7支（一支為空白對照，樣品重復(fù)兩次）各加入稀釋的樣品1mL，40℃水浴預(yù)熱3min，再加入同樣預(yù)熱過的1%干酪素1mL

6、，精確反應(yīng)10min，加0.4mol/L三氯乙酸2mL終止反應(yīng)，混勻水浴沉淀15min后過濾，吸取濾液1mL加入0.4mol/L的Na2CO35mL混勻，再加入1mL福林試劑搖勻置40℃水浴20min，空白測定同上，但在加干酪素之前先加0.4mol/L的三氯乙酸2mL，波長下以空白為對照，用分光光度計(jì)680nm波長下測定樣品的A680酶活力單位定義為：在溫度55℃pH10.0條件下，1min水解酪素產(chǎn)生1μg酪氨酸所需酶量定義為1個(gè)酶活力單位，以U表示。樣品的酶活力X(U/ml)＝A680×K×n×4/10式中：A—樣品平行實(shí)驗(yàn)的平均吸光度K—吸光

7、常數(shù)4—反應(yīng)試劑的總體積(ml)10—反應(yīng)時(shí)間(min)n—稀釋倍數(shù)1.3.2根據(jù)以上發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，選擇有利于產(chǎn)酶的無機(jī)鹽為主要影響因素配置發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵罐控制發(fā)酵，在發(fā)酵前要進(jìn)行電機(jī)的標(biāo)定，發(fā)酵罐的實(shí)消。1.3.3發(fā)酵到10小時(shí)后每隔2小時(shí)利用福林發(fā)測酶活。2結(jié)果與分析2.1堿性蛋白酶酶活力測定標(biāo)準(zhǔn)曲線堿性蛋白酶測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果如圖1所示。由該曲線求得線性回歸方程為：Y=89.317X-2.048，R2=0.9935,K=104.6459本法在酪氨酸濃度0～60μg/ml范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。2.2無機(jī)鹽對枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶

8、的影響由圖2可知無機(jī)鹽離子Fe2+對枯草芽孢桿菌產(chǎn)堿性蛋白的影響比較顯著，原因是Fe2+離子是生物氧化必需的。Fe2+離子