枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶條件的研究

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1、枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶條件的研究摘要：利用單因素法對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶的培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化，確定發(fā)酵培養(yǎng)基各成分最適宜配比。最后確定了該菌株的最適發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(g/100mL):棉籽餅粉3.0,酵母浸粉1.75,麥芽糊精10,檸檬酸鈉0.13,CaCl20.13。K2HPO41.0;最適搖瓶發(fā)酵條件為:接種量2%,裝液量50mL/250mL,搖床轉(zhuǎn)速200r/min,34℃,發(fā)酵54h,堿性蛋白酶的發(fā)酵單位可達(dá)1648.8u/mL。此外,還進(jìn)行了5L罐放大實(shí)驗(yàn),在5L罐所確定的最適工藝條件下,發(fā)酵單位可達(dá)520.2u/mL。關(guān)鍵詞：堿性蛋白酶；枯草芽孢桿菌；發(fā)酵；培養(yǎng)基引

2、言　堿性蛋白酶是指在堿性條件下水解蛋白質(zhì)肽鍵的酶類,主要應(yīng)用于生產(chǎn)加酶洗滌[1],另外,在制革、絲綢、醫(yī)藥、食品、飼料和生物化學(xué)試劑等領(lǐng)域也有應(yīng)用。我國(guó)在20世紀(jì)70年代初期就成功開(kāi)發(fā)了堿性蛋白酶,并實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)[2]。目前,我國(guó)用于生產(chǎn)的菌種為國(guó)內(nèi)學(xué)者自行篩選誘變的菌株———枯草芽孢桿菌,其發(fā)酵單位在10000u/mL,與國(guó)外先進(jìn)水平相差甚遠(yuǎn)[3]。本實(shí)驗(yàn)所采用的產(chǎn)堿性蛋白酶菌株為枯草芽孢桿菌,其實(shí)驗(yàn)發(fā)酵單位為22000u/mL,與國(guó)外大型酶制劑公司所報(bào)道的生產(chǎn)水平30000u/mL相差較大[4]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)該菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基利用單因素實(shí)驗(yàn)確定其基本成分，選擇出適合該菌株發(fā)酵的最適培養(yǎng)基

3、，從而使其酶活有一定的增長(zhǎng),為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。1　材料與方法1.1　菌　株枯草芽孢桿菌(Baci11ussubti1is)。1.2　試劑及儀器酪氨酸、福林酚試劑、三氯乙酸、無(wú)水碳酸鈉、干酪素;棉籽餅粉;酵母浸粉;麥芽糊精;檸檬酸鈉;CaCl2;K2HPO4;KCl由實(shí)驗(yàn)室提供。pH計(jì)、722分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、離心機(jī)。1.3培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨5、葡萄糖10、酵母浸粉5、K2HPO418,pH值自然，105℃蒸氣滅菌20min；搖瓶培養(yǎng)基（g/L）：酵母浸粉0.875、麥芽糊精5、檸檬酸鈉0.15、KCl0.46、CaCl20.15、K2HPO40.5，pH值自然，

4、105℃蒸氣滅菌20min。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸粉5、葡萄糖5、麥芽糊精15、檸檬酸鈉5、KCl8.5、CaCl25、K2HPO43.5，pH值自然，105℃蒸氣滅菌20min。1.4方法1.4.1堿性蛋白酶活力的測(cè)定取發(fā)酵液于4000r/min離心20min取上清液，采用Folin酚法測(cè)定蛋白酶活力[5]。酶活力單位定義為：在溫度55℃pH10.0條件下，1min水解酪素產(chǎn)生1μg酪氨酸所需酶量定義為1個(gè)酶活力單位，以U表示。A680*K*n*4樣品的酶活力(U/ml)＝———————————10式中：A--樣品平行實(shí)驗(yàn)的平均吸光度K--吸光常數(shù)4--反應(yīng)試劑的總體積(ml)10-

5、-反應(yīng)時(shí)間(min)n--稀釋倍數(shù)1.4.2不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶粗酶的影響無(wú)機(jī)鹽分別選用0.02%Na2HPO4、0.02%KCl、0.02%K2HPO4、0.02%NaCl，以不加無(wú)機(jī)鹽為對(duì)照組，在其他條件不變的情況下，以酶活力為指標(biāo)，確定最佳無(wú)機(jī)鹽。2結(jié)果與分析2.1堿性蛋白酶酶活力測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線堿性蛋白酶測(cè)定結(jié)果如圖1所示。由該曲線求得線性回歸方程為：Y=89.317X-2.048，R2=0.9935。本法在酪氨酸濃度0～60μg/ml范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。2.2不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶粗酶酶活力的影響由圖2分析：K2HPO4與Na2HPO4相比較，

6、HPO4~一定時(shí)，Na比K對(duì)芽孢桿菌產(chǎn)酶較好。K2HPO4與KCl相比較，K一定時(shí)，HPO4~比Cl~對(duì)芽孢桿菌產(chǎn)酶有促進(jìn)作用。KCl與無(wú)CaCl2相比較，對(duì)芽孢桿菌產(chǎn)酶無(wú)影響。所述，KCl有利于芽孢桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶。2.3　5L罐發(fā)酵過(guò)程曲線在搖瓶實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,進(jìn)行了5L罐中的放大實(shí)驗(yàn)。裝料系數(shù):017,接種量:4%,溫度:30℃,轉(zhuǎn)速:300r/min。對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的菌體PH、粗酶液中酶活力及發(fā)酵液中OD600進(jìn)行了測(cè)定,所繪發(fā)酵曲線如圖3所示。5L罐發(fā)酵單位最高可達(dá)520.2u/mL。圖3發(fā)酵罐過(guò)程曲線由圖3分析：發(fā)酵到14小時(shí)后取發(fā)酵原液測(cè)出其OD600、酶活和PH都很高。15-21h

7、，沒(méi)貨和OD600都迅速減小，PH也在下降，這段時(shí)間中可能是由于換濾膜而引起了染菌或是溶氧造成的結(jié)果。22-27h，酶活一直在持續(xù)增加，PH相對(duì)減小的比較緩慢，OD600在穩(wěn)定一段時(shí)間后突然增加。28-35h，酶活開(kāi)始持續(xù)降低，PH和OD600也在跟著減小。3結(jié)論采用枯草芽孢桿菌為發(fā)酵菌株，用單因素試驗(yàn)確定了最佳培養(yǎng)基配方和最適發(fā)酵條件，最后得到最佳培養(yǎng)基為（g/L）棉籽餅粉3.0,酵母浸粉1.75,麥芽糊精