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《枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶條件的研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶條件的研究摘要：利用單因素法對枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶的培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化，確定發(fā)酵培養(yǎng)基各成分最適宜配比。最后確定了該菌株的最適發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(g/100mL):棉籽餅粉3.0,酵母浸粉1.75,麥芽糊精10,檸檬酸鈉0.13,CaCl20.13。K2HPO41.0;最適搖瓶發(fā)酵條件為:接種量2%,裝液量50mL/250mL,搖床轉(zhuǎn)速200r/min,34℃,發(fā)酵54h,堿性蛋白酶的發(fā)酵單位可達1648.8u/mL。此外,還進行了5L罐放大實驗,在5L罐所確定的最適工藝條件下,發(fā)酵單位可達520.2u/mL。關(guān)鍵詞：堿性蛋白酶；枯草芽孢桿菌；發(fā)酵；培養(yǎng)基引
2、言 堿性蛋白酶是指在堿性條件下水解蛋白質(zhì)肽鍵的酶類,主要應用于生產(chǎn)加酶洗滌[1],另外,在制革、絲綢、醫(yī)藥、食品、飼料和生物化學試劑等領(lǐng)域也有應用。我國在20世紀70年代初期就成功開發(fā)了堿性蛋白酶,并實現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)[2]。目前,我國用于生產(chǎn)的菌種為國內(nèi)學者自行篩選誘變的菌株———枯草芽孢桿菌,其發(fā)酵單位在10000u/mL,與國外先進水平相差甚遠[3]。本實驗所采用的產(chǎn)堿性蛋白酶菌株為枯草芽孢桿菌,其實驗發(fā)酵單位為22000u/mL,與國外大型酶制劑公司所報道的生產(chǎn)水平30000u/mL相差較大[4]。本實驗對該菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基利用單因素實驗確定其基本成分，選擇出適合該菌株發(fā)酵的最適培養(yǎng)基
3、，從而使其酶活有一定的增長,為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 菌 株枯草芽孢桿菌(Baci11ussubti1is)。1.2 試劑及儀器酪氨酸、福林酚試劑、三氯乙酸、無水碳酸鈉、干酪素;棉籽餅粉;酵母浸粉;麥芽糊精;檸檬酸鈉;CaCl2;K2HPO4;KCl由實驗室提供。pH計、722分光光度計、恒溫水浴鍋、離心機。1.3培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨5、葡萄糖10、酵母浸粉5、K2HPO418,pH值自然，105℃蒸氣滅菌20min；搖瓶培養(yǎng)基（g/L）：酵母浸粉0.875、麥芽糊精5、檸檬酸鈉0.15、KCl0.46、CaCl20.15、K2HPO40.5，pH值自然，
4、105℃蒸氣滅菌20min。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸粉5、葡萄糖5、麥芽糊精15、檸檬酸鈉5、KCl8.5、CaCl25、K2HPO43.5，pH值自然，105℃蒸氣滅菌20min。1.4方法1.4.1堿性蛋白酶活力的測定取發(fā)酵液于4000r/min離心20min取上清液，采用Folin酚法測定蛋白酶活力[5]。酶活力單位定義為：在溫度55℃pH10.0條件下，1min水解酪素產(chǎn)生1μg酪氨酸所需酶量定義為1個酶活力單位，以U表示。A680*K*n*4樣品的酶活力(U/ml)＝———————————10式中：A--樣品平行實驗的平均吸光度K--吸光常數(shù)4--反應試劑的總體積(ml)10-
5、-反應時間(min)n--稀釋倍數(shù)1.4.2不同無機鹽對枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶粗酶的影響無機鹽分別選用0.02%Na2HPO4、0.02%KCl、0.02%K2HPO4、0.02%NaCl，以不加無機鹽為對照組，在其他條件不變的情況下，以酶活力為指標，確定最佳無機鹽。2結(jié)果與分析2.1堿性蛋白酶酶活力測定標準曲線堿性蛋白酶測定結(jié)果如圖1所示。由該曲線求得線性回歸方程為：Y=89.317X-2.048，R2=0.9935。本法在酪氨酸濃度0～60μg/ml范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。2.2不同無機鹽對枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶粗酶酶活力的影響由圖2分析：K2HPO4與Na2HPO4相比較，
6、HPO4~一定時，Na比K對芽孢桿菌產(chǎn)酶較好。K2HPO4與KCl相比較，K一定時，HPO4~比Cl~對芽孢桿菌產(chǎn)酶有促進作用。KCl與無CaCl2相比較，對芽孢桿菌產(chǎn)酶無影響。所述，KCl有利于芽孢桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶。2.3 5L罐發(fā)酵過程曲線在搖瓶實驗基礎(chǔ)上,進行了5L罐中的放大實驗。裝料系數(shù):017,接種量:4%,溫度:30℃,轉(zhuǎn)速:300r/min。對發(fā)酵過程中的菌體PH、粗酶液中酶活力及發(fā)酵液中OD600進行了測定,所繪發(fā)酵曲線如圖3所示。5L罐發(fā)酵單位最高可達520.2u/mL。圖3發(fā)酵罐過程曲線由圖3分析：發(fā)酵到14小時后取發(fā)酵原液測出其OD600、酶活和PH都很高。15-21h
7、，沒貨和OD600都迅速減小，PH也在下降，這段時間中可能是由于換濾膜而引起了染菌或是溶氧造成的結(jié)果。22-27h，酶活一直在持續(xù)增加，PH相對減小的比較緩慢，OD600在穩(wěn)定一段時間后突然增加。28-35h，酶活開始持續(xù)降低，PH和OD600也在跟著減小。3結(jié)論采用枯草芽孢桿菌為發(fā)酵菌株，用單因素試驗確定了最佳培養(yǎng)基配方和最適發(fā)酵條件，最后得到最佳培養(yǎng)基為（g/L）棉籽餅粉3.0,酵母浸粉1.75,麥芽糊精
