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《體外成牙環(huán)境對(duì)牙髓干細(xì)胞和外胚間充質(zhì)干細(xì)胞分化的影響》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫(kù)。
1、體外成牙環(huán)境對(duì)牙髓干細(xì)胞和外胚間充質(zhì)干細(xì)胞分化的影響[]目的利用牙胚細(xì)胞（TGC）作為誘導(dǎo)成牙環(huán)境，將牙髓干細(xì)胞（DPSC）、外胚間充質(zhì)干細(xì)胞（EMSC）分別與其共培養(yǎng)，觀察DPSC和EMSC的分化能力。方法利用出生后4d的大鼠TGC作為誘導(dǎo)成牙環(huán)境，將培養(yǎng)的DPSC、EMSC使用BrdU標(biāo)記及鑒定后與其共培養(yǎng)，免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)標(biāo)記細(xì)胞表面抗原牙本質(zhì)涎蛋白（DSP）的表達(dá)和堿性磷酸酶（ALP）活性的變化，免疫組化染色鑒定及圖像分析DPSC、EMSC在成牙環(huán)境中的分化能力。結(jié)果共培養(yǎng)7d后，EMSC共培養(yǎng)組DSP陽(yáng)性細(xì)胞的轉(zhuǎn)
2、化率高于DPSC共培養(yǎng)組（P<0.05）。免疫組化染色圖像分析結(jié)果表明共培養(yǎng)7d后，共培養(yǎng)組與TGC單獨(dú)培養(yǎng)組差異顯著（P<0.05）。共培養(yǎng)組3、7d后ALP活性明顯增高，EMSC共培養(yǎng)組較DPSC 共培養(yǎng)組ALP活性高。結(jié)論混合培養(yǎng)的TGC作為誘導(dǎo)細(xì)胞分化的微環(huán)境與DPSC、EMSC共培養(yǎng)后，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化，EMSC分化能力高于DPSC?！ 關(guān)鍵詞]牙胚細(xì)胞；牙髓干細(xì)胞；外胚間充質(zhì)干細(xì)胞；細(xì)胞分化 []Q254[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[doi]10.3969/j.issn.1000-1182.
3、2012.06.005 成體干細(xì)胞的增殖和分化離不開特定的微環(huán)境，微環(huán)境中的間質(zhì)細(xì)胞能夠產(chǎn)生一系列生長(zhǎng)因子或配體，與干細(xì)胞相互作用，控制干細(xì)胞的更新和分化?，F(xiàn)有研究表明在不同的誘導(dǎo)條件下干細(xì)胞有向不同細(xì)胞分化的潛能，從而將其作為種子細(xì)胞參與組織的損傷與修復(fù)。牙髓干細(xì)胞（dentalpulpstemcell，DPSC）、外胚間充質(zhì)干細(xì)胞（ectoblastmesenchyme stemcell，EMSC）都屬于牙源性的間充質(zhì)干細(xì)胞，它們?cè)谝欢ǔ裳勒T導(dǎo)環(huán)境中的細(xì)胞表型及功能變化，對(duì)于組織工程化牙齒構(gòu)建中種子細(xì)胞的篩選具有重
4、要的意義。本研究利用出生后4d的大鼠牙胚細(xì)胞（tooth germcell，TGC）作為誘導(dǎo)成牙環(huán)境，將DPSC、EMSC與其共培養(yǎng)，觀察DPSC、EMSC對(duì)牙本質(zhì)特異性蛋白牙本質(zhì)涎蛋白（dentinsialoprotein，DSP）的表達(dá)及堿性磷酸酶（alkalinephosphatase，ALP）活性的變化，觀察DPSC、EMSC在成牙環(huán)境中的分化能力，為今后組織工程化牙齒的構(gòu)建提供有益的探索?！ ?材料和方法 1.1實(shí)驗(yàn)材料 K-SFM無(wú)血清培養(yǎng)液、表皮生長(zhǎng)因子（epidermalgroa公司，美國(guó)），抗Brd
5、u單克 隆抗體（武漢博士德公司），抗牙本質(zhì)涎蛋白多克隆抗體（SantzCruz公司，美國(guó)），熒光二抗：異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、羅丹明（TRITC）標(biāo)記的山羊抗兔IgG（DAKO公司，美國(guó)），激光掃描共聚焦顯微細(xì)胞儀（奧林巴斯公司，日本），ALP試 劑盒（南京建成生物工程研究所）?！ ?.2方法 1.2.1組織塊酶解法培養(yǎng)TGC在體視顯微鏡下，分離出SD仔鼠（出生4d）下頜骨第一磨牙牙胚（組織塊為1mm3），絞碎后放入37℃PBS緩沖液中，Ⅰ型膠原酶和Dispase消化，分離碎屑，離心后用無(wú)血清
6、K-SFM培養(yǎng)液洗滌1次，離心并用含0.15ng·mL-1EGF、25μg·mL-1BPE的K-SFM無(wú)血清培養(yǎng)液將其制成細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每日換液。用細(xì)胞角蛋白多克隆抗體染色進(jìn)行鑒定?！ ?.2.2DPSC和EMSC的BrdU標(biāo)記及鑒定將DPSC和EMSC分別接種于6孔板內(nèi)，板內(nèi)預(yù)先放置細(xì)胞爬片，當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底60%時(shí)，加入BrdU溶液分別孵育48h。取出玻片，PBS沖洗，4%多聚甲醛液固定30min，然后進(jìn)行免疫組化染色鑒定?！ ?.2.3TGC與DPSC、EMSC直接接觸共培養(yǎng)根據(jù)
7、預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將標(biāo)記好的DPSC、EMSC分別與牙胚細(xì)胞以1∶1的比例混合接種于6孔板內(nèi)?！ ?.2.4免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)標(biāo)記細(xì)胞表面抗原DSP的表達(dá)取共培養(yǎng)1、3、7d的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)，采用共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。分別以546nm和490nm波長(zhǎng)的激發(fā)光觀察切片TRITC和FITC所標(biāo)示的抗原（TRITC陽(yáng)性細(xì)胞呈紅色，F(xiàn)ITC陽(yáng)性細(xì)胞呈綠色）；陰性對(duì)照采用一抗添加PBS。每張爬片隨機(jī)選取8～10個(gè)不同的視野，分別計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)及標(biāo)記細(xì)胞的DSP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算各個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞總數(shù)的比值，取其均值，即
8、為細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率?！ ?.2.5共培養(yǎng)細(xì)胞的免疫組化染色鑒定對(duì)共培養(yǎng)的細(xì)胞同時(shí)使用LSAB組化試劑盒檢測(cè)DSP表達(dá)?！ ?.2.6圖像分析[]目的利用牙胚細(xì)胞（TGC）作為誘導(dǎo)成牙環(huán)境，將牙髓干細(xì)胞（DPSC）、外胚間充質(zhì)干細(xì)胞（EMSC）分別與其共培養(yǎng)，觀察DPSC和EMSC的分化能力。方法利用出生后4
