干旱下擬南芥vde基因的基礎功能分析

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1、干旱下擬南芥vde基因的基礎功能分析1緒論1.1擬南芥與干旱擬南芥（Arabidopsis;thaliana)作為生物研究中的一種模式生物，被廣泛的應用于植物學相關的各個領域，它在植物基因工程和作物遺傳改良上的重要地位也受到人們愈來愈多地的重視[1]。通過對擬南芥種子的人工誘變，能夠獲得大量形態(tài)各異的變異株，涉及到植物發(fā)育的各個過程。這些變異株為研究各基因在植物發(fā)育中的功能及其調(diào)節(jié)提供了良好的材料[2]。在干旱條件下，植物經(jīng)常呈現(xiàn)植株萎蔫狀態(tài)，生長受到抑制，最大葉面積、葉面積的生長率、比葉面積(單位重量的葉面積）、葉片數(shù)量以及生物產(chǎn)量都出

2、現(xiàn)顯著的降低[5]。核酸酶活性提高，ATP的合成量減少,蛋白質(zhì)合成受到阻遏，游離脯氨酸、脫落酸、活性氧和丙二酸在植物體內(nèi)積累，超氧化物歧化酶（SOD)、過氧化物酶（POD)、過氧化氧酶（CAT)的活性得到增強。水分脅迫下，植物的用水效率、滲透調(diào)節(jié)能力、光合系統(tǒng)作用、細胞膜穩(wěn)定性以及其抗氧化系統(tǒng)的防御能力等指標的變化常被用來進行植物抵御干早脅迫能力的判定。干旱會導致植物體生理及分子水平上的一系列變化。處于干旱條件下的植物，其ABA濃度要高于水分條件良好的植物，而氣孔導度更低，在葉水勢降低之后氣孔關閉速度相較于水分條件好的植物也要更快。干旱脅

3、迫會引發(fā)膜脂過氧化作用，造成膜系統(tǒng)的損傷，嚴重時會導致植物細胞的死亡。膜脂過氧化的最終產(chǎn)物丙二醛(MDA)又可與細胞膜上的蛋白質(zhì)、酶等結(jié)合、交聯(lián)，從而使之失活，破壞了生物膜的結(jié)構(gòu)與功能。干旱脅迫會導致光合作用速率下降。在干旱條件下，植物葉片的相對含水量以及葉片水勢降低，保衛(wèi)細胞失水，導致氣孔閉合，使C02進入葉片受到限制，從而影響了光合作用速率研究認為，在輕度脅迫下，氣孔關閉是光合作用速率下降的主導因素，但在嚴重干旱脅迫下，植物體內(nèi)參與光合作用的細胞結(jié)構(gòu)被破壞，植物的光合作用能力下降，對C02的同化作用受到抑制。.1.2葉黃素循環(huán)植物葉片

4、吸收的光能常常會超過其光合系統(tǒng)本身所能利用的量，而干旱、鹽漬、溫度脅迫、營養(yǎng)虧缺等逆境條件又會進一步限制植物對于光能的利用[17]。對過剩的光能的吸收能夠?qū)е鹿夂闲实某挚`下降，也就是光抑制。研究表明，光合系統(tǒng)已經(jīng)發(fā)展了多種防御機制來防止過量光能對植物的傷害。其中，依賴于葉黃素循環(huán)對過剩光能進行的無害熱耗散，被認為是植物逆境下一種重要的保護機制[18]。葉黃素類是（X或P胡蘿卜素氧化的衍生物，所有的光合機構(gòu)中均有它們的存在，在光能捕獲、對光合機構(gòu)破壞的防御(photoprotection)以及捕光天線色素復合體(LHC)的組裝過程中起作用

5、[19]。熱耗散主要由葉黃素循環(huán)和黃體素（lutein，L)所完成。葉黃素循環(huán)是由依賴光轉(zhuǎn)化的3個組分：玉米黃質(zhì)（zeaxanthin，Z)、單環(huán)氧玉米黃質(zhì)（antheraxanthin，A)和雙環(huán)氧紫黃質(zhì)（violaxanthin,V)，通過環(huán)氧化和脫環(huán)氧化來發(fā)揮作用的一種循環(huán)機制。葉黃素循環(huán)通過這三種組分之間的轉(zhuǎn)換，將由干旱脅迫導致的過剩光能以非輻射能量的方式耗散，以此來保護植物免受光抑制的傷害。當植物產(chǎn)生過剩光能時，V在紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶(VDE)的作用下經(jīng)脫環(huán)氧化作用形成A，再進一步脫環(huán)氧化形成Z;與此相反，在過剩光能減少時，Z通過

6、玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶(ZEP)的作用環(huán)氧化又可以形成A，再進一步環(huán)氧化形成V,從而完成了熱能有效傳遞與耗散的循環(huán)。這一循環(huán)避免了葉綠體內(nèi)過剩光能的積累，對于精細地調(diào)控葉綠體吸收光能的利用與耗散具有重要的作實驗以培養(yǎng)架培育的擬南芥哥倫比亞野生型（Col.)以及vde缺失體npql-2作為實驗材料。突變體種子購自美國ArabidopsisBiologicalResourceCenter(ABRC)。使用次氯酸鈉溶液對擬南芥種子進行消毒處理，在無菌操作臺上將消毒后的種子播撒到滅菌后的MS固體培養(yǎng)基巾，用封U膜封好，放入4°C冰箱內(nèi)避光春化2

7、-3天。光照培養(yǎng)2周后，將幼苗移栽于輕石介質(zhì)中繼續(xù)培養(yǎng)，并將裝有培養(yǎng)介質(zhì)的容器浸入MS培養(yǎng)液中。培養(yǎng)條件：光周期16h/8h,培養(yǎng)架光強l00fimol。在擬南芥植株生長達到實驗要求后，選取相同生長周期長勢相近的植株進行試驗。PEG-6000是模擬土壤干旱的一種較為理想的滲透調(diào)節(jié)劑，使用PEG-6000誘導水份逆境所得的效果與將土壤逐步干旱相似[34]。我們使用不同濃度PEG-6000溶液進行千旱環(huán)境的模擬，以此為基礎進行實驗。根據(jù)實驗需求，將擬南芥分為以下三種處理：（1)對照組。擬南芥幼苗在MS培養(yǎng)液中正常培養(yǎng)。（2)輕度干旱處理組。擬

8、南芥幼苗使用以與對照組相同MS培養(yǎng)液配置的濃度為5%的聚乙二醇（PEG-6000)溶液進行干旱環(huán)境模擬處理，分別處理Od、Id、2d、3d、4do(3)重度干旱處理組。擬南芥幼苗使用以與對照組