玉米花期干旱脅迫下誘導(dǎo)基因的分離和功能分析

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1、-11108340分類號：密級：單位代碼：10019學(xué)號：B030411·，田蘆茗式粵博士學(xué)位論文玉米花期干旱脅迫下誘導(dǎo)基因的分離和功能分析IsolationandFunctionAnalysisofDroughtStressInducedGenesatthenoweringStageiIlMaKe但動mays)研究生：奎會豆指導(dǎo)教師：至丞主班究旦合作指導(dǎo)教師：鍪．揸研究雖王國篡熬援申請學(xué)位類別：理堂擅士專業(yè)領(lǐng)域名稱：遺焦堂研究方向：撞物基固互猩所在學(xué)院：生物堂院．2007年4月摘要樂米是全球重要的糧、飼兼川作物，也是重要的能源作物，在糧食安

2、全、能源安全等方面起著非常重要的作川。隨著全球性水資源的匱乏和玉米種植面積的不斷擴人，T早愈加成為玉米生產(chǎn)的發(fā)艘的lj艮制1”素。我國有半以卜^的玉米受到干旱的威脅，尤其是在玉米花期，干旱脅迫往往會造成敗育和嚴重減產(chǎn)。但是，由丁對玉米抗早機制，特別是對其開化期抗旱的遺傳機制、對T早脅迫的效應(yīng)研究較少，極人地限制著在向‘種手段與育種材料方面取得突破。本研究以抗早性強的玉米自交系CNl65作為實驗材料，通過采H】抑制差減雜交(SSH)方法構(gòu)建eDNA文庫，分離玉米雌穗和花絲T早脅迫下差異表達的基岡，建立玉米花期干旱脅迫F雌穗雨J花絲誘導(dǎo)基岡表達譜

3、，解析玉米花刺抗旱的分f機理，旨在為玉米抗早育種及相關(guān)研究奠定新的理淪內(nèi)秤。本研究構(gòu)建的eDNA文庫包含1920個M『性克隆，經(jīng)過PCR驗證后測序發(fā)現(xiàn)，1439條EST是有效序列，聚類分析得到361條uniESTs，BLASTX分析表明，有218條uniESTs和數(shù)據(jù)庫中的蛋白序列釘較高的相似性。99條uniESTs和數(shù)據(jù)庫中的核酸序列有較高的相似性，但是找小到匹配的蛋白序列，還有44條uniESTs在GenBank數(shù)據(jù)庫中既沒有相似的核酸序列也沒仃相似的蛋白序列。218個已知功能的基因按照擬南芥功能基㈨組分類的方法可以分為13類，其巾，與代

4、謝相關(guān)的基岡rLl27％，與蛋白質(zhì)合成相關(guān)的基罔^16％，與蛋白質(zhì)加T相關(guān)的基岡占10％，與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的基因lIJ10％，與細胞發(fā)育周期相關(guān)的基陋l占9％。采用cDNAMacroarray的方法對獲得的uniESTs進行分析，結(jié)果表明：160個uniESTs個神：雌穗中是上調(diào)表達的，129個uniESTs在花絲中是上調(diào)表達的．125個uniESTs在雌穗和花絲都是上調(diào)表達的。為了驗證cDNAMacroarray結(jié)果的可靠性，采用實時定量PCR(Real—timequantitativePCR)力法劉cDNA文J：車中的10個uniESTs進行了

5、分析，結(jié)果表明兩種方法獲得的基岡表達量姓不完全、致的，但基岡的表達模式相同，說明利用cDNAMacroarray對cDNA文庫中分離到的基崗進行發(fā)達譜的分析是可行的。在這個cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)了一個和來源丁水稻與擬南芥ERD4基因相似性很I島的uniEST，這個uniEST在干旱脅迫r的雌穗和花絲中都上調(diào)表達的。采爿j5'-RACE和3'-RACE的力法得到丁這個uniEST的cDNA全長，命名為ZmERD4。ZmERD4包含2073個bp，其中1776bp的開放蒯讀框，8bp的5'-UTR和289bp的3"-UTR。Southernblot結(jié)

6、果表明ZmERD4在玉米基吲組中含有一個拷兒。RNAgelblot結(jié)果表明ZmERD4受干。1‘脅迫、高鹽脅迫和ABA的誘導(dǎo)表達，但是小受低溫(4℃)脅迫誘導(dǎo)表達?；〖毎ㄎ唤Y(jié)果表明ZmERD4在細胞核中特異表達；ZmERD4編碼蛋白_二級結(jié)構(gòu)分析顯示它是包含1個信號肽和7個跨膜區(qū)的整合膜蛋向；ZmERD4推導(dǎo)的氨基酸序列共具有8個蛋閂激酶C磷酸化位點(ProteinkinaseCphosphorylationsite)，14個酪蛋白激酶II磷酸化位點(Caseinkinase11phosphorylationsite)和3個1‘四烷基化位點

7、(N—myristoylationsitc)。由J‘蛋向激酶C和酪蛋F1激酶TI在細胞周期凋節(jié)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面有重要的作用，岡此推斷ZmERD4可能在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面受蛋白激酶C和酪蛋白激酶II的調(diào)摔；在逆境脅迫r，N—terminalmyristoylation在膜靶和信號傳導(dǎo)力【蒔巳著重要的作用。這種修飾在蛋白對膜的咀及蛋白之問的相互作用方面是必要的。_L}jZmERD4轉(zhuǎn)化擬南芥，T3代轉(zhuǎn)基岡機株在耐早、抗鹽方面明顯高丁對照植株，這表明ZmERD4神劃．牛物脅迫反應(yīng)中起著重要的作川。關(guān)鍵詞：玉米，下早脅迫，抑制差減雜交，基閃表達，基岡克隆

8、IIAbstractDroughisoneofthemostimportantlimitingfactorsforagriculturalproductioninm