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1、線粒體功能障礙在高糖刺激的小鼠足細(xì)胞凋亡中的作用河北省任丘市華北石油管理局總醫(yī)院腎內(nèi)科河北任丘062552)【摘要】目的：觀察高糖培養(yǎng)的小鼠腎臟足細(xì)胞中凋亡發(fā)生的情況，探討傳統(tǒng)線粒體凋亡途徑在糖尿病小鼠腎臟足細(xì)胞凋亡發(fā)生中的可能作用，以便更深入的了解糖尿病腎損傷的潛在分子機(jī)制。方法：常規(guī)培養(yǎng)小鼠足細(xì)胞，將分化成熟的足細(xì)胞經(jīng)無(wú)血清培養(yǎng)基同步化12h后分為分成2組：正常糖對(duì)照組(NG):D-葡萄糖lg/L;高糖刺激組(HG):D-葡萄糖4.5g/L，分組干預(yù)刺激24h、48h、72h,透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變；TUNEL法及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞
2、凋亡；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體跨膜電位;免疫細(xì)胞化學(xué)和Westernblot檢測(cè)足細(xì)胞中Caspase-3蛋白的表達(dá)變化；Westernblot檢測(cè)CytochromeC蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果：1、透射電鏡結(jié)果顯示，正常足細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，足突形態(tài)細(xì)長(zhǎng)、規(guī)則，基底膜無(wú)明顯增厚，可見(jiàn)少許微絨毛、細(xì)小突起。高糖組腎小球基底膜不規(guī)則增厚，部分足突增寬、融合，近曲小管上皮細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)空泡，線粒體部分嵴消失；2、流式細(xì)胞術(shù)及TUNEL法結(jié)果均顯示：高糖刺激組較正常對(duì)照組細(xì)胞凋亡數(shù)顯著升高；3、高糖培養(yǎng)組較正常對(duì)照組足細(xì)胞線粒體膜電位明顯下降；4、免疫組化結(jié)果：高糖
3、培養(yǎng)組細(xì)胞內(nèi)Caspase-3蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，正常糖對(duì)照組僅有少量陽(yáng)性表達(dá);5、Westernblot結(jié)果:高糖培養(yǎng)組CytochromeC、Caspase-3表達(dá)較正常對(duì)照組增高。結(jié)論：高糖刺激的足細(xì)胞線粒體膜電位明顯下降，釋放到胞質(zhì)中的CytochromeC增高，Caspase-3表達(dá)上調(diào)，提示高糖刺激引起了＞51細(xì)胞中線粒體功能障礙，其相關(guān)凋亡途徑可能參與了足細(xì)胞的凋亡過(guò)程，并在DN的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。【關(guān)鍵詞】糖尿病腎?。痪€粒體功能障礙；足細(xì)胞；高糖；線粒體膜電位【中圖分類號(hào)】R318【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B【文章編號(hào)】1764_8
4、999(2015)7-0799-02并發(fā)癥之-。足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過(guò)屏障的重要成分，在維持腎小球通透性、抵抗毛細(xì)血管內(nèi)的靜水壓、維持毛細(xì)血管襻的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等方面發(fā)揮重要作用。大量研究證實(shí)，足細(xì)胞損傷是DN發(fā)病的啟動(dòng)機(jī)制之一，損傷后的足細(xì)胞數(shù)量減少在腎小球硬化的發(fā)生過(guò)程中起著關(guān)鍵性的作用。凋亡是導(dǎo)致足細(xì)胞丟失的重要因素，在DN的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M體內(nèi)高糖環(huán)境，觀察不冋吋間點(diǎn)體外培養(yǎng)的小鼠足細(xì)胞的凋亡情況，并通過(guò)檢測(cè)線粒體膜電位以及相關(guān)凋亡因子caspase-3、Cyt-c的表達(dá)變化，探討線粒體功能障礙在糖尿病腎病足細(xì)胞凋亡中的作用。
5、1材料與方法1.1足細(xì)胞培養(yǎng)、傳代及凍存1.1.1足細(xì)胞培養(yǎng)將凍存足細(xì)胞在37°C水浴中復(fù)蘇后移入培養(yǎng)瓶，加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液，置于33°C、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育使其增殖；相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞成熟分化后可用于實(shí)驗(yàn)。1.1.2細(xì)胞傳代將足細(xì)胞培養(yǎng)液以胰蛋白酶-EDTA法洗滌、消化后，高速離心,按所需的接種密度接種于培養(yǎng)瓶。1.1.3細(xì)胞凍存以33°C培養(yǎng)的增殖態(tài)足細(xì)胞按照4°C30min、-20°C30-60min、-80°C過(guò)夜、液氮罐長(zhǎng)期保存的順序進(jìn)行凍存。1.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分成2組：正常糖對(duì)照組(NG)
6、:D-葡萄糖lg/L;高糖培養(yǎng)組(HG)：D-葡萄糖4.5g/L,分別經(jīng)細(xì)胞同步化、分組干預(yù)刺激24、48、72h后收集細(xì)胞及上清液，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。1.3透射電鏡觀察足細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變收集細(xì)胞干預(yù)72h后的足細(xì)胞，PBS沖洗,1000r/min離心5min，使細(xì)胞成團(tuán)，小心吸取上清，加入2.5%戊二醛固定，包埋，超薄切片，透射電鏡觀察NG、HG組細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變。1.4方法1.4.1分別采用TUNEL法、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡1.4.2免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)足細(xì)胞中Caspase-3蛋白的表達(dá)1.4.3Westernblot檢測(cè)Cyt-c、C
7、aspase-3蛋白的表達(dá)1.4.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體跨膜電位（mitochondrialtranmembranepitentials，ΔΨm）收集刺激后24、48、72h細(xì)胞,制成l-2×106/ml細(xì)胞懸液，加入Rhl23探針，避光孵育lOmin，離心（lOOOrpm，4min）,在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)為470-490nm，發(fā)射波長(zhǎng)為515-565nm。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)&pluSmn;標(biāo)準(zhǔn)差（＞表示；組間不冋吋間點(diǎn)的比較采用析因設(shè)
8、計(jì)的方差分析，兩兩比較采用LSD方法分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)果以P<0.05為顯著性差異判斷標(biāo)準(zhǔn)。2結(jié)果2.1足細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征透射電鏡觀察，正常足細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，足突形態(tài)
