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《中華按蚊多態(tài)微衛(wèi)星dna位點(diǎn)的篩選和特征研究 》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、中華按蚊多態(tài)微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)的篩選和特征研究【摘要】目的：對中華按蚊多態(tài)的微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)進(jìn)行分離和篩選，并闡明其特征.方法：應(yīng)用中華按蚊基因組DNA的酶切片段與生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針雜交，親合素富集和超濾離心濃縮目的片段，擴(kuò)增放大，克隆并測序，構(gòu)建中華按蚊微衛(wèi)星DNA庫.在其中挑選合適的微衛(wèi)星位點(diǎn)，建立擴(kuò)增體系.應(yīng)用中華按蚊現(xiàn)場樣本擴(kuò)增不同的微衛(wèi)星位點(diǎn)，聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選具有多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn).結(jié)果：構(gòu)建的中華按蚊微衛(wèi)星DNA庫中包含252條序列，GenBank注冊登記號為EF620177?EF620298.其中，雙核苷
2、酸重復(fù)最為常見，三核苷酸重復(fù)次之，多核苷酸重復(fù)少見;含（CA）和（GT）重復(fù)的序列最多，重復(fù)次數(shù)最多可達(dá)56次；完整序列占％，非完整序列占％，復(fù)合序列占％,其余為非典型序列.設(shè)計(jì)了22對引物擴(kuò)增不同的微衛(wèi)星位點(diǎn)，其中20個位點(diǎn)產(chǎn)生特異的PCR產(chǎn)物，PAGE結(jié)果顯示其中15個位點(diǎn)具有多態(tài)性.結(jié)論：獲得了中華按蚊新的多態(tài)微衛(wèi)星位點(diǎn)共15個，為中華按蚊群體遺傳和其他相關(guān)研究提供了分子標(biāo)志.【關(guān)鍵詞】中華按蚊；微衛(wèi)星DNA0引言微衛(wèi)星DNA是一類簡單的短核苷酸串聯(lián)重復(fù)序列，又稱簡單重復(fù)序列，廣泛分布于真核生物的基因組中，每間隔10?50
3、kb即存在一個微衛(wèi)星DNA.微衛(wèi)星DNA包括核心序列和兩側(cè)的側(cè)翼序列，通常核心序列重復(fù)單元長1?6bp，重復(fù)次數(shù)為10?60次，其重復(fù)次數(shù)的差異導(dǎo)致微衛(wèi)星DNA具豐富的長度多態(tài)性［1-2］.微衛(wèi)星DNA已經(jīng)廣泛應(yīng)用于研宄生物多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)、行為生態(tài)和親緣關(guān)系等［3］，是一種理想的的分子標(biāo)志.中華按蚊(AnophelessinensisWiedemann,1828)在我國分布廣且種群數(shù)量大是以往文獻(xiàn)記載中瘧疾和絲蟲病的重要傳播媒介［4-5］.本研究擬構(gòu)建中華按蚊的微衛(wèi)星DNA庫并篩選其中多態(tài)的微衛(wèi)星位點(diǎn)，為中華按蚊基因組學(xué)研
4、究積累基礎(chǔ)資料，并為其相關(guān)研究提供新的分子標(biāo)志.1材料和方法材料構(gòu)建中華按蚊微衛(wèi)星DNA庫的樣本為上海實(shí)驗(yàn)室品系，由中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所提供.現(xiàn)場中華按蚊采自云南思茅(2017?08，n=10)、云南鹽津(2017707,n二10)和湖北武漢(2017?07，n=10)，選擇雌性成蟲為實(shí)驗(yàn)材料.方法微衛(wèi)星DNA庫構(gòu)建基因組DNA的抽提參照Hammond等的文獻(xiàn)進(jìn)行［6］，-20°C保存待用.基因組DNA經(jīng)Sau3AI酶切，回收200?800bp的片段，力卩SAUL接頭連接，接頭序列如下：SAULA?：GCGGT
5、ACCCGGGAAGCTTGG,SAULB?：GATCCCAAGCTTCCGGGTACCGC.以SAULA為引物，連接產(chǎn)物作為模板PCR擴(kuò)增，反應(yīng)液中含PCR緩沖液、mmol/LMgC12,mmol/LdNTP，umol/L引物，UTaq酶（上海生工生物工程有限公司）和2uL模板，在熱循環(huán)儀（PTC?100，美國ABI公司）上執(zhí)行如下程序：72°C5min后，94°Clmin,67°Clmin和72°C2min共32個循環(huán)，72°C延伸5min.將擴(kuò)增產(chǎn)物變性后，與Biotin?16?ddUTP（瑞士Roche公司）標(biāo)記的寡核苷
6、酸探針雜交，探針包括：（AAT）17，（GA）25，（CCT）17,（AC）25,（CAG）17,（CAC）5,（TC）10,帥8和（TG）18.用親和素VectrexAvidinD（英國VectorLabs公司）捕獲并超濾離心（美國Millipore公司）濃縮富集雜交的目的片段.以富集的核酸作為模板，SAULA為引物擴(kuò)增，反應(yīng)體系和程序同前.隨后，用PCR產(chǎn)物再次雜交、捕獲、濃縮富集和擴(kuò)增.將上述擴(kuò)增產(chǎn)物插入TOPO?T載體（美國Invitrogene公司），轉(zhuǎn)化JM109，挑選含微衛(wèi)星DNA序列的陽性克隆，用四色熒光標(biāo)記雙脫
7、氧鏈終止法測序（PE2ABI3770全自動測序儀，上海英駿生物技術(shù)有限公司），應(yīng)用BioEdit（Version）軟件包分析所獲序列.微衛(wèi)星DNA多態(tài)位點(diǎn)篩選單蚊抽提現(xiàn)場中華按蚊基因組DNA，參照文獻(xiàn)進(jìn)行分子鑒別確認(rèn)蚊種為中華按蚊[7].選擇22條重復(fù)次數(shù)較多，且典型的微衛(wèi)星DNA序列，應(yīng)用Primer3（Version）軟件包設(shè)計(jì)引物.以單蚊基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增微衛(wèi)星DNA（反應(yīng)體系和程序同前），退火溫度范圍在55°C?60°C.擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)5%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，銀染、顯色，依據(jù)凝膠上的條帶判斷其是否具有多態(tài)性.2
8、結(jié)果中華按蚊微衛(wèi)星DNA庫構(gòu)建的中華按蚊微衛(wèi)星DNA庫中包含282條序列，其中18條序列完全相同，21條序列較短（小于lOObp），故有效的微衛(wèi)星DNA序列共252條，GenBank注冊號為EF620177?EF620298.分析所獲的微衛(wèi)星DNA序列，顯示其長
