coriolus versicolor固體發(fā)酵產(chǎn)漆酶的研究

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1、Coriolusversicolor固體發(fā)酵產(chǎn)漆酶的研究摘要：研究云芝固體發(fā)酵產(chǎn)漆酶的營(yíng)養(yǎng)條件和培養(yǎng)條件，得出較好的培養(yǎng)基組成：固體發(fā)酵基料選擇麩皮與花生殼，其合適的比例為1：1，液體營(yíng)養(yǎng)鹽中葡萄糖濃度為0.5%，培養(yǎng)基含水率為70%，初始pH為2.0，接種量為20%、培養(yǎng)溫度為30℃。通過(guò)對(duì)產(chǎn)酶條件的優(yōu)化，優(yōu)化后的漆酶的最高酶活力是優(yōu)化前的4.1倍，雜色云芝在該條件下產(chǎn)漆酶，達(dá)到最高酶活需要10天，并且最高酶活可以維持3~4天。關(guān)鍵詞：雜色云芝；固體發(fā)酵；漆酶；發(fā)酵基料漆酶最早是在漆樹(shù)的汁液中發(fā)現(xiàn)的，故將其命名為漆酶。漆酶廣泛存在大量植物、真菌中。分泌漆酶的

2、真菌主要集中于擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina)、子囊菌亞門(Asycotina)及半知菌亞門(Deuteromycotina)等高等真菌，其中最主要的是擔(dān)子菌亞門的白腐真菌。漆酶在食品工業(yè)、造紙工業(yè)、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域中具有廣泛應(yīng)用，Pertersen利用漆酶中銅離子的催化特性，除去色拉、蛋黃醬等食品中溶解的氧，消除了食品中的亞麻酸和溶解氧反應(yīng)生成的揮發(fā)性異味組分。Jujiop通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，用漆酶對(duì)木材中的木質(zhì)素進(jìn)行處理，可以節(jié)省30%的動(dòng)力。本實(shí)驗(yàn)選用雜色云芝為菌種，著重研究雜色云芝固體發(fā)酵產(chǎn)漆酶的營(yíng)養(yǎng)條件和培養(yǎng)條件，從而提高漆酶的活力，使漆酶能得到

3、高效的應(yīng)用。1材料與方法1.1菌種雜色云芝菌(Coriolusversicolor)，南京林業(yè)大學(xué)微生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保藏。菌絲體于4℃保存在PDA斜面培養(yǎng)基上。1.2基本培養(yǎng)基（1）固體斜面培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯200；葡萄糖20；瓊脂20。（2）固體發(fā)酵培養(yǎng)基（/瓶）：麩皮5g；花生殼5g；液體營(yíng)養(yǎng)鹽23mL；吐溫802滴。（3）液體營(yíng)養(yǎng)鹽的配制（/L）：葡萄糖5g；(NH4)SO4；KH2P043g；MgS04·7H2OO.5g；愈創(chuàng)木酚4g；CaCl22g；CuSO40.6mg；0.2mol/LpH5.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液100mL；微量元素濃縮液

4、1mL。（4）微量元素濃縮液的配制（g/L）：MnSO40.3；FeSO4·7H2O3；ZnSO4·7H2O0.3；VB10.1。1.3培養(yǎng)基中漆酶酶活的測(cè)定：在3mL總反應(yīng)體積中，含有0.5mmol/L底物[2，2-連氮-二-（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）簡(jiǎn)稱ABTS1mL，50mmol檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液和酶液共計(jì)2mL。將緩沖液和ABTS在50℃水浴保溫5min后，立即用移液槍添加適量酶液，并同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，分別測(cè)定1min,2min,3min時(shí)420nm處吸光值。定義每分鐘氧化1μmolABTS所需酶量為一個(gè)酶活單位（U）。液體酶活計(jì)算方法：液體酶活力

5、（U/L）=△OD×V1/(V2×t×ε)式中：△OD：吸光度增加值；t：間隔時(shí)間（min）；V1：總反應(yīng)體積（mL）V2：酶液體積；ε：消光系數(shù)（M-1cm-1）[ε420=36000×10－6M-1cm-1]固體酶活計(jì)算方法：固體酶活（U/g原料）=液體酶活力（U/L）×M1×M2式中：M1：提酶時(shí)固體基質(zhì)（g）與所用的緩沖液（L）的比值M2：發(fā)酵以后固體基質(zhì)的濕重（g）與固體原料的重量（g）的比值1.4蛋白含量的測(cè)定方法：采用改良的Bradford法測(cè)定1.5發(fā)酵方法將C.versicolor菌種從PDA培養(yǎng)基上刮到無(wú)菌水中，用勻漿機(jī)打碎菌絲體，開(kāi)低檔，

6、時(shí)間約4s。用移液管吸取3mL菌絲體懸浮液于固體培養(yǎng)基中，在無(wú)菌條件下用玻璃棒攪拌均勻。放置在30℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，并保證一定濕度，培養(yǎng)10天左右。1.6固體酶曲中漆酶的提取稱取1g濕曲，加入49mL檸檬酸緩沖液并充分?jǐn)噭颍?0℃下提取1h。然后將浸泡液于10000rpm,4℃條件下離心5min，得上清液即初酶液。2結(jié)果與討論2.1最佳固體發(fā)酵基料的確定選用稻草、甘蔗渣、玉米芯、玉米皮、花生殼等纖維廢棄物為固體發(fā)酵產(chǎn)漆酶的發(fā)酵基料，各稱取5g放入250ml的三角瓶中，加入5g麩皮、23mL液體營(yíng)養(yǎng)鹽和2滴吐溫80，在30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16天，結(jié)果見(jiàn)圖1

7、。圖1不同纖維原料對(duì)產(chǎn)酶的影響由圖可知，以花生殼為原料時(shí)，云芝分泌漆酶的活力最高（46.4U/g原料)，并且周期較短，達(dá)到最高酶活時(shí)僅需要8天。這是因?yàn)榛ㄉ鷼そY(jié)構(gòu)比較疏松，里面的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更容易被菌絲體利用，而且發(fā)酵過(guò)程中透氣性較好。玉米芯也具有與花生殼類似的特點(diǎn)，所以產(chǎn)酶活力也比較高，僅次于花生殼，但是達(dá)到最高酶活力的時(shí)候比花生殼要多兩天。稻草是常見(jiàn)的農(nóng)業(yè)廢棄物，但是利用稻草固體發(fā)酵產(chǎn)漆酶時(shí)，菌體生很緩慢，漆酶分泌量也很少，這可能是因?yàn)榈静荼砻嬗邢炠|(zhì)，C.versicolor菌絲不能吸收稻草中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因而也就不利于菌體產(chǎn)酶。2.2麩皮和花生殼最佳比例的確定

8、麩皮與上述五種纖維原料有所不同，除了能