退變腰椎間盤組織細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因fas和bcl

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1、退變腰椎間盤組織細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因Fas和Bcl【摘要】目的觀察髓核組織Fas和Bcl2蛋白的表達(dá),探討其在腰椎間盤退變過(guò)程可能發(fā)揮的作用。方法采用原位DNA片斷末端標(biāo)記(TUNEL)和免疫組織化學(xué)方法,檢測(cè)20例退變腰椎間盤(退變組)及6例正常腰椎間盤(對(duì)照組)髓核組織的細(xì)胞凋亡狀態(tài)及凋亡相關(guān)基因Fas和Bcl2的表達(dá)。結(jié)果退變組及對(duì)照組髓核組織細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)分別為(50.23±13.36)和(28.32±6.67)(P<0.05),Fas蛋白陽(yáng)性細(xì)胞百分比(74.26±10.

2、15)%和(41.72±4.62)%(P<0.01),Bcl2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞百分比(55.37±13.65)%和(27.17±5.17)(P<0.01)。凋亡細(xì)胞越多,Fas和Bcl2的表達(dá)越強(qiáng)。結(jié)論Fas和Bcl2蛋白均參與腰椎間盤組織中細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié),可能在腰椎間盤退變中發(fā)揮重要作用?！娟P(guān)鍵詞】椎間盤腰椎細(xì)胞凋亡1991年,Tompson用細(xì)胞培養(yǎng)方法觀察細(xì)胞因子對(duì)椎間盤細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)更新的影響[1],國(guó)內(nèi)外學(xué)者現(xiàn)已認(rèn)識(shí)到細(xì)胞因子在腰椎間盤髓核細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著重要的作

3、用。有關(guān)細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因在退變性疾病的發(fā)生及進(jìn)展中所起作用越來(lái)越受到重視[2]。多種細(xì)胞因子可直接或間接影響髓核細(xì)胞的凋亡,如高水平NO可以促進(jìn)髓核細(xì)胞凋亡,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1可以抑制髓核細(xì)胞凋亡等[23]。筆者觀察退變腰椎間盤組織細(xì)胞凋亡狀態(tài)及凋亡相關(guān)基因Fas、Bcl2的表達(dá)情況,探討其在腰椎間盤退變過(guò)程的作用。1材料與方法1.1標(biāo)本(1)退變組:退變腰椎間盤組織(L3～5)取自2003年12月～2004年12月住院手術(shù)的腰椎間盤突出癥患者的髓核標(biāo)本,共20例,男性13例,女性7例

4、,年齡(45.20±15.72)歲(21～69歲)。納入標(biāo)準(zhǔn):有典型臨床癥狀、體征及相應(yīng)MRI表現(xiàn),術(shù)后病理證實(shí)椎間盤組織明顯退變。(2)對(duì)照組:正常腰椎間盤組織(L3～5)取自同期本院骨科脊柱創(chuàng)傷需手術(shù)治療的患者(術(shù)前均簽訂取材知情同意書),共6例,男性3例,女性3例,年齡(32.50±14.36)歲(24～56歲)。納入標(biāo)準(zhǔn):傷前無(wú)慢性腰背痛史,MRI無(wú)示椎間盤退變征象,術(shù)后組織學(xué)檢查椎間盤組織無(wú)明顯退變。1.2方法1.2.1原位DNA片斷末端標(biāo)記采用脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導(dǎo)的原位

5、缺口末端標(biāo)記法(TUNEL法),細(xì)胞核呈藍(lán)黑色者為陽(yáng)性細(xì)胞,即凋亡細(xì)胞。每例計(jì)數(shù)10個(gè)400倍視野,以平均100個(gè)細(xì)胞中含凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)為凋亡指數(shù)(AI)。1.2.2免疫組織化學(xué)使用SP免疫組織化學(xué)試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司),一抗為兔抗人Fas單克隆抗體和鼠抗人Bcl2單克隆抗體。所有標(biāo)本均在同一條件下采用鏈霉蛋白素生物素法[LSAB(SP)法]進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,各步驟間均用PBS洗片。陽(yáng)性對(duì)照選用經(jīng)病理檢查確診為淋巴瘤的病理石蠟切片,用PBS代替一抗為陰性對(duì)照。細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕

6、黃色顆粒為染色陽(yáng)性細(xì)胞,每例切片用400倍鏡雙盲法計(jì)數(shù),細(xì)胞數(shù)不少于400個(gè),并計(jì)算細(xì)胞陽(yáng)性率(%)。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理資料以x±s表示。采用Studentt檢驗(yàn)和多重線性回歸分析。2結(jié)果2.1腰椎間盤髓核組織中,Fas、Bcl2蛋白表達(dá)在軟骨細(xì)胞,其細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒狀染色(圖1)。腰椎間盤髓核組織中,凋亡細(xì)胞為軟骨細(xì)胞,其細(xì)胞核呈藍(lán)黑色。對(duì)照組與退變組腰椎間盤髓核組織中細(xì)胞AI、Fas與Bcl2蛋白表達(dá)見表1。2.2運(yùn)用多重線性回歸分析髓核細(xì)胞表達(dá)的Fas、Bcl2蛋白與髓核

7、細(xì)胞AI的關(guān)系,獲得一多元線性回歸方程:Y＝0.671X1－0.124X2＋6.419Y:髓核細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI);X1、X2:髓核組織中細(xì)胞表達(dá)Fas,Bcl2蛋白的陽(yáng)性率.表1對(duì)照組與退變組腰椎間盤髓核組織中髓核細(xì)胞凋亡指數(shù)及Fas、Bcl2蛋白表達(dá)程中各系數(shù)均不為零,回歸方程有意義。又由于該方程相關(guān)系數(shù)的平方值為0.418,表示這兩個(gè)自變量一起,可以解釋因變量41.8％變異性。3討論腰椎間盤長(zhǎng)期受各種應(yīng)力作用勞損較重,在壓力、張力、扭轉(zhuǎn)、震蕩等反復(fù)作用下,椎間盤內(nèi)壓力增加,水分丟失,氧

8、張力下降,細(xì)胞活力下降甚至死亡,基質(zhì)成分如蛋白多糖、硫酸軟骨素等減少,這些均促成腰椎間盤退變[5]。腰椎間盤退行性變是導(dǎo)致腰椎間盤突出癥的基本病因,退變腰椎間盤主要病理改變?yōu)樽甸g盤細(xì)胞量減少及椎間盤基質(zhì)的降解[6]。既往的研究表明,椎間盤中多種生長(zhǎng)因子類保護(hù)性細(xì)胞因子生成及分泌的減少以及多種炎性損傷性細(xì)胞因子的增多,是造成髓核細(xì)胞直接或間接大量凋亡的重要原因,并最終導(dǎo)致椎間盤退變甚或椎間盤突出。其中,Fas分子對(duì)髓核細(xì)胞的促凋亡作用已獲得共識(shí),但對(duì)于Bcl2分子的作用卻有不同觀點(diǎn)[7]。Fas