[應(yīng)用文書]應(yīng)用文書

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1、項(xiàng)目11：乙型肝炎病毒標(biāo)志物的檢測(cè)【目的要求】1、熟悉ELISA的原理擴(kuò)操作方法。2、掌握乙肝病毒標(biāo)志物的臨床意義。【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】　　乙型肝炎病毒目前培養(yǎng)困難，臨床主要測(cè)定乙型肝炎病毒的各種抗原和抗體做輔助診斷。實(shí)驗(yàn)室常用對(duì)流免疫電泳法及反向間接血凝法。目前臨床上多用固相酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。【原理】①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用

2、洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應(yīng)效果，從而使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。　雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原最常用的方法，將特異性抗-HBs吸附于固相載體表面，當(dāng)加入待檢血清中相應(yīng)的HBsAg時(shí)，結(jié)合形成Ag-Ab復(fù)合物，加入過氧化物酶標(biāo)記的抗-HBs酶結(jié)合物，有酶相應(yīng)底物存在情況下，產(chǎn)生顏色變化，用肉眼判讀或酶標(biāo)儀測(cè)定結(jié)果。間

3、接法是檢測(cè)抗體最常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測(cè)已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。先將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)；后加稀釋的受檢血清，其中的特異抗體與抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合，在洗滌過程中被洗去?！静牧稀俊　?．包被液：0.2MpH9.6的碳酸鹽緩沖液2．洗滌液：0.02MpH7.4的PBS-Tween20(0.05％)液3．酶結(jié)合物：用辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗－HBs4．酶抗體稀釋液：0.01MpH7.4的PBS

4、-Tween20(0.05％)液5．酶底物液：鄰苯二胺(OPD)10mg溶于pH5.0的磷酸鹽-檸檬酸緩沖液25m1中，臨用前加入30％H2O212ml。新鮮配制，避光6．中止液：2MH2SO47．待檢血清、陽性血清、陰性血清8．聚苯乙烯微量板，微量移液器，吸頭等【方法】1．包被：用包被液稀釋抗-HBs為50ug／ml，加入微量板100ul/孔，置40℃過液后，用洗滌液洗3次每次3~5min。2．加樣：加入稀釋為1／50的待檢血清100ml／孔每個(gè)標(biāo)本作2孔，同時(shí)作陽性、陰性和空白對(duì)照，置37℃2h后洗滌3次。3．加酶結(jié)合物：加入經(jīng)適當(dāng)稀釋的酶結(jié)合物100ul／孔

5、，置37℃2h后洗滌3次。4．加底物液100ul/孔，避光置于37℃20~30min。5．中止反應(yīng)：加1滴／孔中止液。【結(jié)果】　　肉眼判讀時(shí)，待測(cè)孔顏色與陰性對(duì)照一樣或更淺，判為陰性。若明顯加深，呈黃棕色，判為陽性。用酶標(biāo)儀檢測(cè)時(shí)，P／N值＞2．1為陽性，＜2．1為陰性。P為被檢標(biāo)本OD值，N為陰性對(duì)照OD值?！　「戒洠骸。ㄒ唬┮腋尾《颈砻鏄?biāo)志檢測(cè)的臨床意義1．稱大三陽，為慢性肝炎，處于活動(dòng)期。有較強(qiáng)的傳染性。2．稱小三陽，為慢性攜帶者，乙肝已趨向恢復(fù)，傳染性弱，如持續(xù)時(shí)間過久，可轉(zhuǎn)化為肝癌。　　3．感染階段或慢性乙肝表面抗原攜帶者，傳染性弱?！　?．感染過乙肝病

6、毒，具有一定的免疫力，為不典型的恢復(fù)期或?yàn)榧毙砸腋胃腥酒凇?．乙肝感染，為肝炎恢復(fù)期，少數(shù)人仍有傳染性。6．去有乙肝感染或現(xiàn)在正處于急性感染。7．前打過乙肝疫苗或以前感染過乙肝。8．性乙肝恢復(fù)期，以前感染過乙肝。9．急性感染早期或者慢性乙肝表面抗原攜帶者，傳染性弱。10．慢性乙肝表面抗原攜帶者，較易轉(zhuǎn)陰，或者是急性感染，趨向恢復(fù)。11．早期乙肝感染，或慢性攜帶者，傳染性強(qiáng)。12．急性乙肝感染趨向恢復(fù)，或者為慢性攜帶者?！　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。ǘ㏄CR方法檢測(cè)病原微生物　　多聚酶鏈反

7、應(yīng)(polymerasechainreaction，PCR)是一種模擬天然DNA復(fù)制過程，在體外擴(kuò)增特異性DNA（或RNA）片段的新技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)是將待檢雙鏈DNA經(jīng)94℃高溫變性成單鏈作模板，然后加入一對(duì)人工合成的寡核苷酸引物，引物分別與待擴(kuò)增DNA片段的兩端互補(bǔ)，經(jīng)55℃低溫退火，引物與模板互補(bǔ)結(jié)合。在72℃條件下，結(jié)合于模板上的引物在DNA聚合酶的催化下，利用反應(yīng)體系中的4種dNTP為原料，按堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式延伸合成兩條新的DNA鏈。經(jīng)過20-30個(gè)周期后，特異的目的DNA可擴(kuò)增百萬倍以上。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后即可觀察到特異的擴(kuò)增條帶。PCR方法操作

8、簡(jiǎn)便，靈敏