腦和脊髓損傷對(duì)骨折股骨骨痂中ngf表達(dá)影響

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1、腦和脊髓損傷對(duì)骨折股骨骨痂中NGF表達(dá)影響：郭靜芹徐進(jìn)亮梁愛(ài)琴崔瑞耀【關(guān)鍵詞】脊髓［摘要］目的研究大鼠腦和脊髓損傷后骨折股骨骨痂中神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）表達(dá)的變化。方法成年健康雌性odelsethod,expressionsofNGFinbonycallusinedbyimmunohistochemicalassay.ResultsTheanimalmodelsinsimplefracturegroupappearedatypicalhealingcourse,NGFexpressededsloationandN

2、GFpositiveexpressionatearlystage,andboneformationoralfractures;nervegrowthfactors;rats,Wistar臨床上，四肢骨折并發(fā)腦和脊髓損傷時(shí)，骨折處骨痂過(guò)度生長(zhǎng)，甚至在肌肉中出現(xiàn)異位骨化，骨折愈合明顯快于單純的四肢骨折。臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明，骨的生長(zhǎng)、修復(fù)受神經(jīng)因素的影響，感覺(jué)和自主神經(jīng)纖維分布在骨及骨膜上，其釋放的神經(jīng)肽在骨折愈合重建中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠股骨骨折并發(fā)腦或脊髓損傷動(dòng)物模型，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法研究股骨骨折后不同時(shí)

3、間點(diǎn)骨痂的變化和骨痂中神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）的表達(dá)，探討中樞神經(jīng)損傷對(duì)骨折愈合的影響和機(jī)制。1材料與方法1.1動(dòng)物分組成年健康雌性g/kg）腹腔注射麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上。常規(guī)消毒，無(wú)菌操作，取股外側(cè)縱行切開(kāi)1cm，經(jīng)股前、外側(cè)肌間隔分離至股骨，用線鋸切斷股骨中段，然后行克氏針?biāo)枨荒嫘泄潭?，逐層縫合切口，消毒包扎。術(shù)后放置籠中，常規(guī)飼養(yǎng)，自由活動(dòng)與取食。1.2.2股骨骨折并腦損傷組完成上述手術(shù)后，在顱頂沿正中線切開(kāi)皮膚，顯露右頂骨，于中線旁2mm處用骨鉆鉆開(kāi)直徑5mm骨窗，暴露硬腦膜。將動(dòng)物置于重力打擊裝置下

4、，用質(zhì)量20g的金屬砝碼于30cm高處，通過(guò)玻璃導(dǎo)向管自由墜落，撞擊置于硬腦膜上的圓柱形撞擊桿，造成中度腦損傷。迅速移開(kāi)打擊裝置，逐層縫合切口，消毒包扎。其中有3只大鼠撞擊后當(dāng)場(chǎng)死亡，死亡的大鼠再補(bǔ)齊。術(shù)后放置籠中，每8h擠尿1次，常規(guī)飼養(yǎng)，自由活動(dòng)與取食。1.2.3股骨骨折并脊髓損傷組完成股骨骨折手術(shù)后，于動(dòng)物背部常規(guī)消毒，無(wú)菌操作，縱行切開(kāi)皮膚及皮下組織，剝離棘突旁肌肉，切除第7胸椎棘突及椎板，暴露硬脊膜。將動(dòng)物置于重力打擊裝置下，用質(zhì)量20g的金屬砝碼于5cm高處，通過(guò)玻璃導(dǎo)向管自由墜落，撞擊置于硬脊膜上的

5、圓柱形撞擊桿，造成中度脊髓損傷。迅速移開(kāi)打擊裝置，逐層縫合切口，消毒包扎。應(yīng)用改良Tarlov評(píng)分法測(cè)評(píng)大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能狀況［2］。1.3標(biāo)本采集和切片制備各組動(dòng)物在規(guī)定的觀察時(shí)間點(diǎn)分批麻醉后，經(jīng)左心室依次灌注生理鹽水200mL和40g/L多聚甲醛300mL。立即在無(wú)菌操作下，沿骨折部位上、下各1cm處用線鋸截取股骨，置于40g/L多聚甲醛中后固定2h，蒸餾水浸泡4h，然后放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.20乙二胺四乙酸二鈉中3~4周，充分脫鈣（以用針頭能輕易扎穿骨皮質(zhì)為宜）。修剪股骨標(biāo)本長(zhǎng)約1cm，常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透

6、明，石蠟包埋，沿股骨長(zhǎng)軸縱行連續(xù)切片，片厚7μm，粘于多聚賴氨酸處理的切片上，置4℃冰箱中備用。1.4蘇木精伊紅染色切片染色后，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞漿呈淡紅色。1.5免疫組織化學(xué)染色兔抗鼠NGF多克隆抗體、SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。按照試劑盒說(shuō)明操作，DAB顯色，觀察骨痂組織成骨細(xì)胞及纖維母細(xì)胞內(nèi)NGF表達(dá)情況，細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞。陰性對(duì)照以0.1mmol/L的PBS代替一抗，不出現(xiàn)陽(yáng)性著色。1.6陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和吸光度的檢測(cè)每個(gè)標(biāo)本在高倍鏡（400倍）下隨機(jī)觀察骨痂

7、處4個(gè)不重疊的視野，應(yīng)用WIDAS21圖像分析系統(tǒng)計(jì)算每個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。2結(jié)果2.1組織學(xué)觀察2.1.1單純骨折組表現(xiàn)為典型的骨折愈合過(guò)程，骨痂呈梭形向外膨脹，骨膜反應(yīng)輕，纖維骨痂量少，膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨并存，以前者為主。骨折第4天骨膜開(kāi)始增厚，骨膜內(nèi)形成的軟骨細(xì)胞及纖維母細(xì)胞的量逐漸增多。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，成骨細(xì)胞增多，骨痂層逐漸增厚，至骨折第14天已形成典型的骨小梁結(jié)構(gòu)。2.1.2股骨骨折并腦損傷組早期表現(xiàn)為血腫和炎性滲出增多，成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞較少；骨折第7天成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞開(kāi)始增多；第14天出現(xiàn)成

8、骨細(xì)胞及纖維性骨痂形成。2.1.3股骨骨折并脊髓損傷組骨折第1天表現(xiàn)為血腫和炎性滲出反應(yīng)，骨膜明顯增厚；第4天開(kāi)始骨膜內(nèi)層形成軟骨細(xì)胞，成纖維細(xì)胞明顯增多，形成纖維性骨痂；第7天纖維骨痂中的軟骨細(xì)胞團(tuán)增大，有的融合在一起，軟骨內(nèi)骨化少，骨膜下軟骨細(xì)胞層增厚；第14天仍可見(jiàn)大量纖維骨痂和軟骨骨痂，軟骨細(xì)胞團(tuán)周邊有少量結(jié)構(gòu)稀疏的編織骨形成，外骨膜下的軟骨層尚未完全轉(zhuǎn)變成編織骨