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《枯草芽孢桿菌mrp系統(tǒng)基因克隆和表達的研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、摘要本課題選定嗜堿菌的Mrp(multipleresistanceandpHadaptation)Na+／H+反向載體作為研究對象。MrpN—，曠反向載體是分布于細胞膜上的次級轉(zhuǎn)運蛋白系統(tǒng)，在調(diào)節(jié)嗜堿菌細胞質(zhì)pH衡穩(wěn)方面起關(guān)鍵作用。嗜堿菌膜蛋白系統(tǒng)介導(dǎo)的細胞外和胞內(nèi)間的Na+循環(huán)是其嗜堿適應(yīng)性的重要基礎(chǔ)，而Na+／I-I+反向載體是Na+循環(huán)過程中的關(guān)鍵因素之一。MrpNd／i-i+反向載體是存在于嗜堿菌Bacillus的反向載體系統(tǒng)，是由七個基因編碼的膜蛋白組成的異體蛋白復(fù)合體。本研究對枯草芽孢桿菌Mrp系統(tǒng)基因進行克隆及表達研究，分析枯草芽孢桿菌的嗜堿機理，從而更
2、有效的將嗜堿菌應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)中。本研究分為三個部分：1．pTTQl8表達載體構(gòu)建及Mrp融合蛋白的表達：本部分實驗用PCR技術(shù)擴增得到mrp操縱子的主要基因mrpABC、mrpD，插入到pTTQl8質(zhì)粒中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pTTQl8．mrpABC，pTTQl8．mrpD并用雙酶切和序列測定對重組質(zhì)粒進行測定。然后以構(gòu)建好的pTTQl8．mrpABC重組質(zhì)粒反向PCR擴增出pTTQl8-mrpAB、pTTQl8·mrpA，同樣對pTTQl8一mrpAB、pTTQl8-mrpA進行雙酶切和序列測定。然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL21中進行表達研究，并且以含有MBP蛋白基因
3、的pGJLl6質(zhì)粒做表達對照。實驗結(jié)果表明含有重組質(zhì)粒pTTQl8一mrpABC、pTTQl8-mrpAB、pTTQl8-mrpA、pTTQl8-mrpD的BL21菌株誘導(dǎo)表達抽提膜蛋白跑SDS．PAGE并沒有發(fā)現(xiàn)明顯的表達，含pGJLl6質(zhì)粒的對照菌株能夠正常表達。2．大腸桿菌酸性磷酸酶(EcAP)作為膜蛋白表達伴侶的研究：利用大腸桿菌酸性磷酸酶(Escherichiacoliacidphosphatase，EcAP)作為表達伴侶，對膜蛋白進行了表達嘗試。大腸桿菌酸性磷酸酶分布于大腸桿菌膜間隙，分子量約為48kDa，其序列、功能、結(jié)構(gòu)已有多篇文獻報導(dǎo)。本課題所選定表
4、達的目標(biāo)膜蛋白為源于大腸桿菌的核苷酸轉(zhuǎn)運蛋白NupC和源于枯草芽孢桿菌的MRPNa+／H+反向載體系統(tǒng)的MrpD亞基，其中NupC分子量為44kDa，MrpD分子量為55kDa?；谛蛄械耐負鋵W(xué)結(jié)構(gòu)預(yù)測表明兩種膜蛋白的N端都位于膜間隙，因此如果在N端連接表達伴侶EcAP，目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)和功能被破壞和影響的幾率較小。實驗結(jié)果表明N端結(jié)合了EcAP的EcAP．NupC和EcAP．MrpD能夠進行異源表達，說明EcAP能夠作為表達伴侶促進膜蛋白表達。3．MBP(maltose—bindingprotein)蛋白作為膜蛋白表達伴侶的研究：本研究是基于本實驗室已有的pMAL．p4
5、X質(zhì)粒，構(gòu)建pMAL-p4X[MBP-NupC]質(zhì)粒和pMAL．p4X[MBP-MrpD]。pMAL-p4x質(zhì)粒中含有MBP基因。具體步驟為，利用PCR技術(shù)將mrpD和nupC基因分別從含有相應(yīng)基因的質(zhì)粒擴增出來，經(jīng)酶切消化后作為插入片段，插入到pMAL-p4x載體中，構(gòu)建pMAL．p4X[MBP-NupC]和pMAL．p4X[MBP-MrpD】重組質(zhì)粒。含有重組質(zhì)粒pMAL．p4X[MBP-NupC]和pMAL．p4X[MBP-MrpD]的BL21菌株在M9培養(yǎng)基培養(yǎng)，加IPTG進行誘導(dǎo)表達重組膜蛋白的研究。實驗結(jié)果表明N端結(jié)合了MBP的MBP—NupC和MBP．M
6、rpD能夠進行異源表達，說明MBP能夠作為表達伴侶促進膜蛋白表達。關(guān)鍵詞：嗜堿菌，NaYH+反向轉(zhuǎn)運載體，Mrp系統(tǒng)，克隆表達lIAbstractTheresearchselectsMrp—dependentN式暇antiportersofBacillusastheobject．Mrp-dependentN0暇antiportersofBacillusaresub—membranetransportproteindistributedinthecellmembrane，whichplayakeyroleinregulatingcytoplasmicpHvalue．Na
7、+cyclebetweenextracellularandintracellularwhichismediatedbyalkaliphilicbacteriamembraneproteinisanimportantbasisforalkalophilicadaptation。Na+／H—antiporterisakeyfactorintheprocessofNa+cycle．MrpN0嚼antiportersencodedbysevengeneswhichexistinthealkaliphilicbacteriaBacillusaregiantpr
