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《枯草芽孢桿菌Mrp系統(tǒng)基因的克隆與表達研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、武漢理工大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要本課題選定嗜堿菌的Mrp(multipleresistanceandpHadaptation)Na+／I-I+反向載體作為研究對象。MrpNa+／I-I+反向載體是由六至七個基因編碼的膜蛋白組成的異體蛋白復(fù)合體，是分布于細胞膜上的次級轉(zhuǎn)運蛋白系統(tǒng)，在調(diào)節(jié)嗜堿菌細胞質(zhì)pH衡穩(wěn)方面起關(guān)鍵作用。嗜堿菌膜蛋白系統(tǒng)介導(dǎo)的胞外和胞內(nèi)間的Na●循環(huán)是其嗜堿適應(yīng)性的重要基礎(chǔ)，而Na+／I-1斗反向載體是Na+循環(huán)過程中的關(guān)鍵因素之一。其中MrpF基因編碼了一種分子量15KD的膜蛋白，并且irpF與鈉離子偶聯(lián)轉(zhuǎn)運器之間的關(guān)系及其與鈉離
2、子電壓門控通道之間的關(guān)系已經(jīng)受到廣泛關(guān)注。雖然有跡象顯示MIpF具有膽酸轉(zhuǎn)運活性，但是尚未有實驗證據(jù)證明其介導(dǎo)Na+與膽酸之間的偶聯(lián)轉(zhuǎn)運。本研究從枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌中成功擴增了Mrp系統(tǒng)基因，并且構(gòu)建了N端帶有麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)標簽的表達載體，其中MrpF基因達到了異源超量表達，并用親和層析法得到純化。本研究涉及到基因克隆、融合表達載體的構(gòu)建、融合蛋白表達與純化與蛋白活性一系列分子生物學(xué)與基因工程的實驗內(nèi)容，設(shè)計如下研究方案：(1)基因克?。韩@取枯草芽孢桿菌的模式菌，提取其基因組DNA分子，根據(jù)mrp操縱子的特性在目的基因的兩側(cè)設(shè)計
3、引物，所設(shè)計引物包含了合適的限制性內(nèi)切酶酶切位點，通過PCR技術(shù)擴增目的基因mrpE、F、G；(2)融合表達載體的構(gòu)建：用合適的限制性內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒載體和擴增的目的基因產(chǎn)物，要求所選擇的質(zhì)粒載體帶一個有助于目標蛋白表達與純化標簽和一個抗性標記，設(shè)計連接體系，連接酶連接，最后轉(zhuǎn)化入克隆和表達宿主菌，經(jīng)過篩選和酶切驗證獲取正確的重組質(zhì)粒；(3)表達與純化：在表達宿主菌中誘導(dǎo)表達重組蛋白。摸索優(yōu)化表達條件，以達到異源超表達，從而獲取足量的重組蛋白。親和層析法純化重組蛋白，進一步研究其功能和結(jié)構(gòu)。，(4)蛋白活性研究：選擇合適的底物，利用等溫滴定微量量
4、熱法研究蛋白與底物之間的相互作用關(guān)系，推測蛋白的功能活性。關(guān)鍵詞：嗜堿菌，Nd／H+反向轉(zhuǎn)運載體，Mrp系統(tǒng)，克隆表達，純化武漢理工大學(xué)碩士學(xué)位論文AbstractThisissueselectedtheMrpNa+／曠antiportersinalkaliphilesbacillusformestudy．InBacillussubtilis，theMrpantiporterismembraneproteincomplexesencodedbyalloperonconsistingofmrpABCDEFGgenes．Alkaliphilesme
5、mbraneprotein-mediatedNa+effiuxintracellularandextracellularisallimportantbasisforthealkalophilicadaptation，andtheNa+／礦antiporterisoneofthekeyfactorsintheprocessofNa+effiux．ThemrpFgeneinmrpoperonisencodingamembraneproteinwithamolecularweightof15kDa．ThereareindicationsthatMrp
6、FofB．subtilisexhibitscholatetransportactivity．Inthepresentwork，weclonedthemrpFgencfromBacillussubtilisstrain168andgenerateanexpressionvectorsharbouringN-terminalMBPtaggedMrpFproteins．TheMBP—MrpFproteinwasover-expressedinEscherichiacoilstrainBL21(DE3)andpurifiedtohomogeneousb
7、yaffinitychromatography．Thisstudyinvolvedaseriesofmolecularbiologyandgeneticengineeringexperimentcontent：genecloning，fusionexpressionvectorconstruction，thefusionproteinexpressionandpurification．Wedesignedresearchprogramsasfollows：(1)Genecloning：ToobtainamodelofBacillussubtil
8、isbacteria,extractgenomicDNAmolecule．Accordingtothecharacteristicsofmrpoper
