產(chǎn)硫酸軟骨素酶菌株篩選、發(fā)酵、酶分離純化及性質(zhì)是研究

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1、產(chǎn)硫酸軟骨素酶菌株的篩選、發(fā)酵、酶的分離純化及性質(zhì)的研究產(chǎn)硫酸軟骨素酶菌株的篩選、發(fā)酵、酶的分離純化及性質(zhì)的研究摘要硫酸軟骨素酶在研究硫酸軟骨素類糖胺多糖的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)與功能等方面有多種重要用途。近年來(lái)，該酶在臨床領(lǐng)域的應(yīng)用廣泛，用來(lái)治療某些疾病如大骨節(jié)病、椎間盤突出等。同時(shí)，該酶在制備低分子量硫酸軟骨素方面也存在著廣闊的應(yīng)用前景。因此，獲得酶活力高的硫酸軟骨素酶具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。本研究從微生物中篩選出一株高產(chǎn)硫酸軟骨素酶的菌株，并對(duì)菌株的發(fā)酵培養(yǎng)條件、酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)等做了系統(tǒng)的研究。通過(guò)初篩和復(fù)篩從

2、采集的樣品中獲得了一株高產(chǎn)硫酸軟骨素酶菌株，編號(hào)為28，對(duì)其形態(tài)和生理生化特性進(jìn)行了測(cè)定，初步鑒定該菌株為少動(dòng)鞘氨醇單胞茵(Sphingomonaspaucimobilis)。該菌株所產(chǎn)的硫酸軟骨素酶為胞外酶。為了提高產(chǎn)酶菌株的產(chǎn)酶能力，采用單次單因素實(shí)驗(yàn)方法對(duì)其進(jìn)行了發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化。得到的最適發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(％，w／v)：酵母粉1．O+硫酸軟骨素0．5+NaClO．5+KH2P040．03+MgS04．7H2O0．5，起始pH8．5：最適發(fā)酵培養(yǎng)條件為：搖瓶培養(yǎng)1．0％接種量、250mL搖瓶裝量40mL、2

3、5℃、100r／min振蕩培養(yǎng)36h，酶活力可達(dá)1．2U／mL。硫酸軟骨素酶的分離純化，采用了(NH4)2S04沉淀、DEAE．SepharoseFastFlow陰離子交換層析及SephadexG一100凝膠過(guò)濾層析等純化步驟，結(jié)果獲得了電泳純的硫酸軟骨素酶，酶純化倍數(shù)為155．62，酶收率為46．87％，比活力為98．04U／mg。經(jīng)SDS—PAGE電泳呈單條帶，分子量約為82．3kDa。酶學(xué)性質(zhì)的研究包括pH、溫度、金屬離子、底物濃度和底物專一性等。結(jié)果顯示：該酶為誘導(dǎo)酶，在不添加硫酸軟骨素的培養(yǎng)基中沒有酶活性

4、；該酶的最適反應(yīng)pH值為6．5，最適反應(yīng)溫度為40'C；在實(shí)驗(yàn)所涉及的金屬離子中，大部分金屬離子對(duì)酶反應(yīng)無(wú)影響；該酶對(duì)底物具有相對(duì)專一性，能降解硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸和肝素等這一類結(jié)構(gòu)相似的硫酸軟骨素類糖胺聚糖，而對(duì)甲殼素和殼聚糖無(wú)降解作用。對(duì)該硫酸軟骨素酶的酶解產(chǎn)物進(jìn)行了質(zhì)譜分析，結(jié)果顯示該酶的降解產(chǎn)物幾產(chǎn)硫酸軟骨素酶菌株的篩選、發(fā)酵、酶的分離純化及性質(zhì)的研究乎全為二糖，純度較高，測(cè)得的降解產(chǎn)物的分子量約為458Da。關(guān)鍵詞：硫酸軟骨素酶；發(fā)酵條件優(yōu)化；分離純化；酶學(xué)性質(zhì)lI產(chǎn)硫酸軟骨素酶菌株的篩選、發(fā)酵、酶的分離

5、純化及性質(zhì)的研究StudyontheScreening，F(xiàn)ermentationofChSase—ProducingStrains，andPurificationandPropertiesoftheChSaseAbstractChondroitinasehasavarietyofapplicationsinmanyways，suchasstudyingtheglycosaminoglycans’structure，propertiesandfunctionsandSOon．Recentyearstheapplica

6、tionofChSaseintheclinicalfieldisextensive，curingsomediseasessuchastheKeshinBeckdisease，intervertebraldiscprotrasionandSOon．Atthesametime，italsohasabroaduseinpreparinglowmolecularweightchondroitinsulfate．Soitisofimportanttheoreticalandpracticalsignificanceforge

7、ttingChSasewithhighenzymeactivity．ThisstudyscreenedaChSase—producingstrainwithhighactivity，andresearchedthefermentation，purification，andpropertiesoftheChSasesystematically．ThestrainwithhighChSaseactivity,numbered28，wasobtainedfromthesoilspecimenbymethodsofprel

8、iminaryandsecondscreening．ItwasidentifiedtobeSphingomonaspaucimobilisaccordingtobiologicalcharacteristicsandbiochemicalreactiontests．TheChSaseproducedbythestrainwasextracellular—en