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《產(chǎn)甲殼素酶菌株的發(fā)酵條件、酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、萬方數(shù)據(jù)第40卷第10期2010年lO月中國海洋大學(xué)學(xué)報PERIoDICAL()F0CEANUNIVERSITYoFCHINA40(i0)：057～062Oct．。2010產(chǎn)甲殼素酶菌株的發(fā)酵條件、酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究韓寶芹1，伊金玲1，蔡文娣2，楊艷1，董文1，劉萬順1(1．中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東青島266003；2．濰坊醫(yī)學(xué)院，山東濰坊261042)摘要：利用甲殼素為唯一碳源從土壤中篩選得到1株產(chǎn)甲殼素酶活力較高的菌株HD002，初步鑒定其為Massilia屬。確定菌株產(chǎn)甲殼素酶的最適培養(yǎng)基組成為(g
2、／L)：(NHn)2S045，K2HP040．7，KHzP040．3，MgS(h·7H201，膠體甲殼素10；最適產(chǎn)酶堵養(yǎng)條件為：培養(yǎng)基起始pH值6．0，培養(yǎng)時問192h，發(fā)酵液酶活力達1．314u／mL。采用70％飽和度硫酸銨鹽析、DEAE-SepharoseF．F陰離子交換層析、Sephadex@75凝膠過濾層析對該甲殼素酶進行純化，SDSPAGE證明達到電泳純。該甲殼素酶的分子母為60．2kDa，最適反應(yīng)溫度為55℃，最適反應(yīng)pH值為5．0，Cu2+和F一+對酶活力有明顯的抑制作用，Ca2十和Na’對酶活力有明顯
3、的促進作用。關(guān)鍵詞：甲殼素酶；發(fā)酵條件；分離純化；酶學(xué)性質(zhì)中圖法分類號：Q555文獻標志碼：A文章編號：1672—5174(2010)10—057—07甲殼素是地球上除纖維素外數(shù)量最大的大然高分子多糖，亦是地球卜除蛋白質(zhì)外數(shù)量最大的天然含氮有機化合物，廣泛存在于蝦、蟹、昆蟲等的甲殼以及真菌和植物的細胞壁中[1]。甲殼素的降解產(chǎn)物——幾丁寡糖是1種功能性寡糖，具有抑菌、抗腫瘤、保濕、提高植物防御力等功能[2。5j，已被廣泛應(yīng)用到各個領(lǐng)域。通過化學(xué)法降解甲殼素制備幾丁寡糖反應(yīng)條件苛刻，穩(wěn)定性差，副產(chǎn)物多，環(huán)境污染嚴重；而酶
4、法降解甲殼素反應(yīng)條件溫和，穩(wěn)定性好，產(chǎn)物均一，無污染。因此，酶法降解甲殼素具有非常好的應(yīng)用前景。目前，酶法降解甲殼素面臨的最大困難是，甲殼素酶活力低，生產(chǎn)周期長，成本高，不能大規(guī)模應(yīng)用。因此，篩選得到產(chǎn)甲殼素酶活力高的菌株具有重要的研究意義。本文從海邊土壤取樣，篩選了1株產(chǎn)甲殼素酶活力較高的菌株，在進行了菌株的初步鑒定基礎(chǔ)上，對發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，并對分離純化的甲殼素酶進行了酶學(xué)性質(zhì)研究。1材料和方法1．1材料1．1．1供試菌株從海邊土壤篩選得到，菌株編號HD002。1．1．2發(fā)酵培養(yǎng)基組成(g／L)(NI-h)2s0
5、45，K2HP040．7，KH2P040．3，MgS04·7H201，膠體甲殼素10，調(diào)整pH=6．0。1．1．3膠體甲殼素將200mI。H2S()。溶液(50％濃收稿只期：2010—04—07；修訂口期；2010—05—12作者簡介：韓寶芹(1963一)，女，教授。E-mail：baoqinh@OUC．edu．cn度)緩緩加入盛有20g甲殼素粉末的燒杯中，迅速攪拌，30min后，緩慢加入約1500mI。自來水，不斷攪拌，然后分裝到500mL離心杯中，4000r／min離心15min，將上清液倒出，向沉淀中加入自來水重
6、新懸浮，反復(fù)離心洗滌膠體至pH值中性，再用蒸餾水離心洗滌3次即可，制得的膠體甲殼素放入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?．2菌種鑒定I．2．116SrDNA序列測定用TIANGEN細菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)提取DNA。引物為細菌16SrDNA通用引物：B8F：5，-AGAGTTTGATC—CTGGCTCAC--3’和B1510：5"-GGTTACCTTGT—TACGACTT一3’。PCR體系(50gL)：10Xbuffer(無M礦’)5弘L，25nmol／I。MgCl23弘L，2．5mmol／LdNTP1弘L，Taq5
7、U／mI．0．25弘L，模板1肛L，弓I物l(50tLmol／L)0．5肚I。，引物2(50tlmol／L)0．5弘L，雙蒸水38．75肚L。PCR程序：94℃預(yù)變性5min，94℃變性lmin，55℃退火1min，72℃延伸lmin30s，30個循環(huán)，72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物由南京金斯瑞生物科技有限公司測序，然后登陸NCBI網(wǎng)站將測序結(jié)果與已有序列進行比對。1．2．2形態(tài)和生理生化指標鑒定形態(tài)鑒定：通過顯微鏡觀察菌體制片對菌株HD002進行形態(tài)特征鑒定。生理牛化指標鑒定：根據(jù)該菌株16SrDNA序列的比對結(jié)果
8、，將其進行初步定位。然后采用BIOL(好法進行菌株生理生化指標鑒定。在《伯杰氏細菌鑒定手冊》第九版L6j查閱與其相似度達99％的種所在科，并萬方數(shù)據(jù)中國海洋大學(xué)學(xué)報對照比較此科下所有屬的生理生化特征，進行菌株鑒定。1．3發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化將5mL種子液(培養(yǎng)48h)接種于150mI，液體發(fā)酵培養(yǎng)基(盛放于500mL錐形瓶)中，培養(yǎng)
