菊粉酶酶源誘變菌株產(chǎn)酶發(fā)酵條件的優(yōu)化

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1、菊粉酶酶源誘變菌株產(chǎn)酶發(fā)酵條件的優(yōu)化摘要為提高黑曲霉（Aspergillusniger）A24誘變菌株產(chǎn)菊粉酶的活力，采用單因子試驗(yàn)方法對(duì)該菌株的最佳產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：該菌株在以3%菊芋汁為碳源、2%牛肉膏和0.5%（NH4）2HPO4為復(fù)合氮源的培養(yǎng)基中，初始pH值6.0，30℃培養(yǎng)72h的條件下，所得的發(fā)酵液中酶活力最高，達(dá)到35.21U/mL，比優(yōu)化前提高了18%，表明該菌株有一定的應(yīng)用潛力。　　關(guān)鍵詞黑曲霉；菊粉酶；酶活力；發(fā)酵條件；優(yōu)化　　傳統(tǒng)果糖的生產(chǎn)一般是由淀粉通過葡萄糖的異構(gòu)化取

2、得，該法工藝復(fù)雜、成本較高、果糖含量低。因此，人們一直在尋求一種廉價(jià)的新糖源和生產(chǎn)果糖的方法。其中菊粉酶（Inulinase或Inulase）主要催化水解菊粉中的β-2，1呋喃果糖苷鍵，由于能在溫和條件下水解菊粉產(chǎn)生果糖（70%以上）和少量葡萄糖，只需一步酶解過程，工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，可直接制備超高果葡糖漿，已成為果糖工業(yè)化生產(chǎn)的主要酶制劑，為低聚果糖的生產(chǎn)提供了一個(gè)很好的解決辦法。但于植物的菊粉酶底物專一性較強(qiáng)，僅作用于菊粉；由微生物產(chǎn)生的菊粉酶大都能水解含有β-2，1呋喃果糖苷鍵的多種糖類，如菊糖、蔗

3、糖和棉子糖等[1]。其中霉菌具有所產(chǎn)菊粉酶的最適溫度較高、熱穩(wěn)定性好、適宜偏酸性的環(huán)境等特點(diǎn)而倍受關(guān)注。由濰坊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室所保存的黑曲霉（Aspergillusniger）A24誘變菌株是從菊芋根際周圍土壤中篩選出的一株產(chǎn)菊粉酶、又經(jīng)過多輪紫外線誘變獲得的菊粉酶產(chǎn)量較高的菌株。該試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)一步優(yōu)化，以期獲得更高的產(chǎn)菊粉酶活力，為進(jìn)一步研究菊粉酶的生產(chǎn)以及生產(chǎn)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。　　1材料與方法　　1.1供試材料　　黑曲霉（Aspergillusniger）A24誘變菌株，由濰坊學(xué)

4、院生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。菊芋（HelianthustuberosusL.）采自濰坊市郊區(qū)。菊芋汁參照前人研究方法進(jìn)行制備[2]?！　?.2發(fā)酵培養(yǎng)條件及發(fā)酵液的制備　　取0.1mL黑曲霉孢子懸液，接入50mL的YJ（初始培養(yǎng)條件：菊粉2%，酵母膏0.3%，（NH4）2HPO41%，初始pH值6.0）發(fā)酵培養(yǎng)液中（250mL三角瓶），在不同條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。　　1.2.1不同碳源對(duì)產(chǎn)菊粉酶的影響。選擇碳源分別為2%的菊芋汁、菊粉、葡萄糖、果糖、庶糖和乳糖，將黑曲霉A24誘變菌種接入到不同碳源的培養(yǎng)基中，調(diào)

5、節(jié)各培養(yǎng)基初始pH值為6.0，在30℃、120r/min的條件下培養(yǎng)72h，將各處理的發(fā)酵液經(jīng)8000r/min離心10min后，收集上清液，分別測(cè)定酶活力。并選擇出最優(yōu)碳源，以1%、2%、3%、4%的添加量研究不同濃度的該最優(yōu)碳源對(duì)產(chǎn)菊粉酶的活力影響?！　?.2.2不同氮源對(duì)產(chǎn)菊粉酶的影響。用3%的菊芋汁作碳源，以不同種類的復(fù)合氮源（有機(jī)和無機(jī)）制備的培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)3d后，測(cè)定其發(fā)酵液中菊粉酶活力，確定最佳有機(jī)氮源；在確定最佳有機(jī)氮源為牛肉膏、無機(jī)氮源為（NH4）2HPO4的基礎(chǔ)上，進(jìn)行有機(jī)氮源和無機(jī)氮源

6、最佳配比試驗(yàn)。以牛肉膏和（NH4）2HPO4做復(fù)合氮源發(fā)酵試驗(yàn)，取質(zhì)量濃度分別為1%、2%、3%的牛肉膏和質(zhì)量濃度分別為0.3%、0.5%、0.8%的（NH4）2HPO4進(jìn)行復(fù)合。調(diào)培養(yǎng)基初始pH值為6.0，于30℃，發(fā)酵培養(yǎng)3d，將各處理的發(fā)酵液經(jīng)8000r/min離心10min后，收集上清液，分別測(cè)定酶活力?！　?.2.3培養(yǎng)基初始pH值對(duì)產(chǎn)菊粉酶的影響。設(shè)培養(yǎng)基初始pH值分別為3、4、5、6、7，以3%菊芋汁作碳源，以牛肉膏、（H4）2HPO4為復(fù)合氮源，于30℃條件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)3d。將各處理的發(fā)酵液

7、經(jīng)8000r/min離心10min后，收集上清液，分別測(cè)定酶活力?！　?.2.4發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)菊粉酶的影響。以3%菊芋汁為碳源、2%牛肉膏和0.5%（NH4）2HPO4為復(fù)合氮源、初始pH值6.0的發(fā)酵培養(yǎng)基，對(duì)黑曲霉A24誘變菌株分別在24、26、28、30、32℃下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)72h，將各處理的發(fā)酵液經(jīng)8000r/min離心10min后，收集上清液，分別測(cè)定酶活力?！　?.2.5發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)菊粉酶的影響。以3%菊芋汁為碳源、2%牛肉膏和0.5%（NH4）2HPO4為復(fù)合氮源，培養(yǎng)基初始pH值為6.0，30

8、℃下分別發(fā)酵24、48、72、96、120h，每隔24h取樣。將各處理的發(fā)酵液經(jīng)8000r/min離心10min后，收集上清液，測(cè)定酶活力?！　?.3發(fā)酵液中還原糖含量及菊粉酶的活力測(cè)定　　采用3，5-二硝基水楊酸法[3]測(cè)定發(fā)酵液中還原糖的含量，在540nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，根據(jù)葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得還原糖的含量；酶活力定義為在規(guī)定反應(yīng)條件下每分鐘轉(zhuǎn)化底物生成1μmol還原糖所需的酶量為一個(gè)酶活單位（U/mL