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1、產(chǎn)糖化酶菌株的誘變一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1）學(xué)習(xí)了解工業(yè)微生物育種的基本原理。2）學(xué)習(xí)利用物理因素（紫外光）誘變育種的方法。
3）對有一定能力產(chǎn)糖化酶的菌種進(jìn)行紫外線誘變，并獲得產(chǎn)酶能力更強(qiáng)的突變菌株。
二、實(shí)驗(yàn)原理
利用物理或化學(xué)因素處理微生物細(xì)胞群體，促使其中少數(shù)細(xì)胞的遺傳物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而引起菌體發(fā)生遺傳性的變異，再用合理的篩選方法從群體中篩選出少數(shù)具有優(yōu)良性狀的菌株，這種育種方法稱為誘變育種。誘變育種是提高菌種產(chǎn)量，獲得新型變異菌株的主要手段。
紫外線（UV）是一種最常用有效的物理誘變因素。其誘變效應(yīng)主要是由于它引起DNA結(jié)構(gòu)的改變（鏈或氫鍵的斷裂，胞嘧啶的
2、水合作用、胸腺嘧啶二聚體的形成）而造成的。紫外線誘變一般采用15W或30W紫外線殺菌燈，照射距離為20cm～30cm，照射時(shí)間為1～3min，死亡率控制在50%～80%為宜，被照射處理的細(xì)胞，必須呈均勻分散的單細(xì)胞菌懸液狀態(tài)，以利于均勻接觸誘變劑，并可減少不純菌的出現(xiàn)。
三、實(shí)驗(yàn)材料
1、微生物菌種
產(chǎn)糖化酶的霉菌
2、培養(yǎng)基與試劑
1）增值培養(yǎng)基：硝酸鈉：2g磷酸氫二鉀：1g硫酸鎂:0.5g氯化鉀0.5g硫酸亞鐵0.01g蔗糖:30g瓊脂:15g篩選培養(yǎng)基：可溶性淀粉1.3%,(NH4)2SO40.3%,KH2PO40.1%,MgSO4·7H2O0.05%,FeSO
3、·7HO0.001%、瓊脂粉1.8%加熱溶解，分裝后121℃滅菌20min、自然pH。
誘導(dǎo)產(chǎn)生孢子：在37℃和5℃的條件下交替進(jìn)行培養(yǎng)。3、玻璃器皿：培養(yǎng)皿30套、150mL三角瓶、試管數(shù)支、量筒、接種環(huán)等
4、儀器：恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱、紫外燈（30W）、電子天平、超凈工作臺、冷藏箱、高壓蒸汽滅菌鍋。
四、實(shí)驗(yàn)方法和步驟
（一）培養(yǎng)基的制備增值培養(yǎng)基：硝酸鈉：2g磷酸氫二鉀：1g硫酸鎂:0.5g氯化鉀0.5g硫酸亞鐵0.01g蔗糖:30g瓊脂:15g篩選培養(yǎng)基：可溶性淀粉1.3%,(NH4)2SO40.3%,KH2PO40.1%,MgSO4·7H2O0.05%,FeSO
4、·7HO0.001%、瓊脂粉1.8%加熱溶解，分裝后121℃滅菌20min、自然pH。
（二）滅菌與平板斜面制備
將裝有培養(yǎng)基的三角瓶塞上棉花，并用報(bào)紙包好，拴上繩子。再用報(bào)紙包30套培養(yǎng)皿、30根竹簽、試管等實(shí)驗(yàn)器皿。將上述材料放置于高壓滅菌鍋內(nèi)進(jìn)行滅菌，注意試管要直立放置。嚴(yán)格遵守高壓滅菌鍋的使用方法。（三）活化菌種并促其產(chǎn)孢
將培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的平板，接種環(huán)（針）、活化培養(yǎng)皿、酒精燈放在超凈工作臺。用接種環(huán)（針）挑取保存的菌種在平板上迅速劃動，注意勿劃破培養(yǎng)基，寫好標(biāo)簽。做好后將活化平板倒置放在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h。待菌株長出后，改變其培養(yǎng)環(huán)境，如將培養(yǎng)基放
5、于冰箱一會再放回培養(yǎng)箱中，待其產(chǎn)孢后用加有少量吐溫80的緩沖液或生理鹽水洗平板內(nèi)霉菌的孢子，制成孢子懸液,在磁力攪拌器下攪拌14分鐘。則得到10-1的孢子懸液，再用移液槍汲取1ml10-1濃度的孢子液于9ml無菌水中，搖勻，即為10-2濃度樣品，同法依次稀釋到10-3，塞上塞子，寫好編號、時(shí)間和樣品名稱。（四）、鏡檢
取孢子懸液于載玻片上制成水侵片，在顯微鏡下觀察是否為單孢子懸液，若發(fā)現(xiàn)孢子液不是單個(gè)的孢子，則可以在孢子液中加入適量的幾丁質(zhì)酶或蝸牛酶。
（五）、計(jì)數(shù)
（1）鏡檢計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室
在加樣前，先對計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢，若有污物則需清洗。
1、用95％酒精輕
6、輕沖洗計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室。
2、用蒸餾水清洗計(jì)數(shù)板，然后用吸水紙吸干其上的水分，最后用擦鏡紙擦干凈。
（2）加樣品
1、將潔凈的蓋片置于血球計(jì)數(shù)板的兩條嵴上。
2、用無菌滴管吸取少許搖勻的孢子液由蓋玻片邊緣滴一小滴，注意不宜加過多孢子液，加樣前要搖勻菌液，加孢子液時(shí)不得使計(jì)數(shù)室內(nèi)有氣泡，兩個(gè)平臺上都滴加孢子液。
3、讓孢子液沿細(xì)縫靠毛細(xì)滲透作用自行滲入計(jì)數(shù)室，并充滿計(jì)數(shù)室平臺。
計(jì)數(shù)
加樣后靜置約5min后，將血球計(jì)數(shù)板置于顯微鏡鏡臺上，先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室所在的位置，再轉(zhuǎn)換成高倍鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。
（3）、計(jì)算方法
1、不同規(guī)格的計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)方法有所差異。1625規(guī)格的計(jì)數(shù)板
7、，需要按對角線方位計(jì)算左上、左下、右上和右下4個(gè)中格（共100小格）的菌液；2516規(guī)格的計(jì)數(shù)板，除統(tǒng)計(jì)上述4個(gè)中格外，還須統(tǒng)計(jì)中央一中格共5個(gè)中格（共80小格）的菌數(shù)。
2、計(jì)數(shù)時(shí)當(dāng)遇到位于中格線上的菌體時(shí)，一般只計(jì)數(shù)此中格上方及右方線上的菌體（或只計(jì)數(shù)此中格下方及左方線上的菌體）。
3、若在計(jì)數(shù)前或計(jì)數(shù)時(shí)發(fā)現(xiàn)菌懸液太濃，需重新稀釋后再計(jì)數(shù)。
4、每一樣品重復(fù)計(jì)數(shù)3～5次，取平均值。注意每次數(shù)值不應(yīng)相差過大，否則重新操作。
（4）清洗血球計(jì)數(shù)板
使用完畢將血球計(jì)數(shù)板用流水清洗干凈，切勿用硬物洗刷。洗完后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干，并鏡檢觀察計(jì)數(shù)室內(nèi)是否
