甜酒曲中根霉糖化酶菌株的紫外誘變選育-綜

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1、甜酒曲中根霉糖化酶菌株的紫外誘變選育實驗名稱：實驗一﹑工業(yè)微生物菌種分離一，實驗?zāi)康模?﹑加深對發(fā)酵工程上游技術(shù)中菌種篩選的認識；2﹑學會常規(guī)選種方法；3﹑樹立科學認真仔細的態(tài)度，培養(yǎng)科研協(xié)作精神。二，實驗內(nèi)容：甜酒曲中根霉糖化酶菌株的分離純化三，實驗原理：根霉能產(chǎn)糖化酶，脂肪酶，血纖維蛋白溶解酶等酶系。甜酒曲主要用于制作甜酒釀，在甜酒釀制作過程中，甜酒曲是主要的發(fā)酵制劑。甜酒曲是糖化菌及酵母制劑，其所含的微生物主要有根霉、毛霉及少量酵母。根霉的菌絲無隔膜、有分枝和假根，營養(yǎng)菌絲體上產(chǎn)生匍匐枝，匍匐枝的節(jié)間形成特有的假根，從假根處向上叢生直立、不分枝的

2、孢囊梗，頂端膨大形成圓形的孢子囊，囊內(nèi)產(chǎn)生孢囊孢子。孢子囊內(nèi)囊軸明顯，球形或近球形，囊軸基部與梗相連處有囊托。根霉的孢子可以在固體培養(yǎng)基內(nèi)保存，能長期保持生活力。菌落疏松或稠密，最初呈白色，后變?yōu)榛液稚蚝诤稚?。菌絲匍匐爬行，無色。假根發(fā)達，分枝呈指狀或根狀，呈褐色。孢囊梗直立或稍彎曲，2－4株成束，與假根對生，有時膨大或分枝，呈褐色，長210－2500μm，直徑5－18μm,囊軸呈球形或近球形或卵圓形，呈淡褐色，直徑30－200μm．囊托呈楔型。孢子囊呈球形或近球形，老后呈黑色，直徑60－250μm．抱囊抱子呈橢圓形、球形或其他形，呈黃灰色，直徑5－

3、8μm．有厚垣飽子，其形狀、大小不一致，未見接合抱子。該菌于37－40℃能生長。可采用稀釋涂布法和平板畫線法進行分離。稀釋涂布法原理：稀釋涂布平板法是將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進行培養(yǎng)。在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將被分散成單個細胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個的菌落。平板畫線分離法原理：平板劃線分離法是指把混雜在一起的微生物或同一微生物群體中的不同細胞用接種環(huán)在平板培養(yǎng)基表點擊此處添加圖片說明面通過分區(qū)劃線稀釋而得到較多獨立分布的單個細胞，經(jīng)培養(yǎng)后生長繁殖成單菌落，通常把這種單菌落當

4、作待分離微生物的純種。有時這種單菌落并非都由單個細胞繁殖而來的，故必須反復(fù)分離多次才可得到純種。其原理是將微生物樣品在固體培養(yǎng)基表面多次作“由點到線”稀釋而達到分離目的的。四，實驗步驟：馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基的制備馬鈴薯200g蔗糖20g自來水1000mL瓊脂20gpH自然（約6.0）馬鈴薯去皮，切成塊煮沸半小時，用紗布過濾，濾液加糖加瓊脂，溶化后補足水至1000ml，裝入三角瓶。培養(yǎng)基凝固前，在無菌條件下，倒裝于9個無菌培養(yǎng)皿中，制成平板培養(yǎng)基。2.無菌器材的準備各種類型的移液管若干；{第一輪需要7支1ml移液管（至少），1支10ml移液管，}普通培養(yǎng)皿若

5、干；{第一論需要9個培養(yǎng)皿；第二輪需要3個培養(yǎng)皿（配置培養(yǎng)基）}無菌生理鹽水若干；（氯化鈉8.5g；蒸餾水1000ml；121℃高壓滅菌15min）試管；{第一輪需要6支試管；第三輪（約4天）天后需要3支試管用于斜面接種培養(yǎng)（配置培養(yǎng)基）}錐形瓶。3.菌懸液的制備準確稱取1.0000g甜酒曲于裝有9ml無菌生理鹽水的錐形瓶中，蓋上瓶塞，輕輕搖勻，備用。（1ml移液管1支，裝有9ml無菌生理鹽水的試管1支）4.稀釋將制得菌懸液，以10倍梯度稀釋，依次得到~各個稀釋度的菌懸液。（需要1ml移液管5支，5支裝有9ml無菌生理鹽水的試管，1支10ml的移液管）

6、5.稀釋涂布接種培養(yǎng)在培養(yǎng)基中加入0.1%去氧膽酸鈉溶液，以抑制根霉的過快生長。選取~,3個稀釋度的菌懸液進行接種，用涂布平板法進行接種。在無菌操作條件下從~的稀釋液中各取出各0.2mL涂布于馬鈴薯培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，每個稀釋度接種3個培養(yǎng)皿。貼好標簽，將接種好的培養(yǎng)基在30℃培養(yǎng)2d。（需要9個無菌培養(yǎng)皿，前面用過的2支移液管可以重復(fù)用，還需額外1支無菌移液管）6.初步鑒定培養(yǎng)結(jié)束后，進行菌落觀察和顯微鏡檢，根據(jù)菌落形態(tài)和個體形態(tài)來識別根霉。菌落形態(tài)：菌落的大小，菌絲的高矮，生長密度，孢子顏色以及菌落表面。個體形態(tài)：制水浸片觀察。制水浸片觀察：于潔凈的

7、載片中央，滴加一小滴乳酸石炭酸溶液，然后用接種針從菌落邊緣挑取少許菌絲體置于其中，使其攤開，輕輕蓋上蓋片（注意勿出現(xiàn)氣泡），置于10×10倍數(shù)下觀察。觀察菌絲是否有橫隔，假根，匍匐枝，孢子囊梗，孢子梗及胞囊胞子。7.平板畫線接種培養(yǎng)在步驟6的培養(yǎng)皿中，找到長勢最好的3個目標菌落，用接種環(huán)在挑取菌落生長形態(tài)良好，菌落顏色為白色的根霉，在無菌操作條件下，用接種環(huán)在已配置并滅菌過的培養(yǎng)基上進行劃線，運用平板劃線分離法對根霉進行接種。每個目標菌落平板畫線3個平板，貼好標簽，將接種好的培養(yǎng)基在30℃培養(yǎng)2d。（需要3個培養(yǎng)皿）8.初步鑒定糖化力用碘液在步驟7中培

8、養(yǎng)后的培養(yǎng)基上進行涂抹，根據(jù)菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈來區(qū)別產(chǎn)酶菌株。根據(jù)HE值大小來初步判斷糖化