菊粉酶酶源菌株篩選及其基因克隆

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1、!"卷#期微生物學(xué)報(bào)&’()!".’)#"$$"年%月!"#$%&"’()&(*(+&"$,&-&"$*+,-"$$"!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!菊粉酶酶源菌株篩選及其基因克隆張苓花王運(yùn)吉"葉淑紅張福琪（大連輕工業(yè)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程系大連//%$$/）摘要：篩選出一株產(chǎn)菊粉酶酶源菌株56/$，鑒定為黑曲霉（!"#$%&’(()"*’&$%）。789擴(kuò)增56/$的內(nèi)切菊粉酶基因’*)5/并進(jìn)行核苷酸序列分析。結(jié)果表明’*)5/全長/11/:;，沒有內(nèi)含子，所編碼的氨基酸序列中，存在!個潛在的.4

2、糖基化位點(diǎn)，其中存在菊粉酶的保守序列<=.>7.。以;?8//@為克隆載體，以+),-(’*=/$0為受體菌株，獲得菌粉酶基因克隆。關(guān)鍵詞：黑曲霉，菊粉酶，基因克隆中圖分類號：A@/"文獻(xiàn)標(biāo)識碼：5文章編號：$$$/4%"$0（"$$"）$#4$#"/4$1［/，"］菊粉酶（B,+(C,DE-’FB,+(DE-）可分為兩類，一類是內(nèi)切菊粉酶（>,G’C,+(C,DE-，>8#)")/)2），主要水解產(chǎn)物是寡聚糖；另一類為外切菊粉酶（>H’C,+(C,DE-，>8#)")/)@$），水解產(chǎn)物主要是果糖。菊粉酶廣泛存在于植物和微生物中。利用菊粉酶水解菊粉生產(chǎn)寡聚果糖或超高果

3、糖漿，具有巨大的工業(yè)應(yīng)用潛力。野生型微生物菊粉酶表達(dá)量比較低，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建菊粉酶基因工程菌，有望提高菊粉酶的表達(dá)量。國外已報(bào)道了來源于節(jié)桿菌（!%./%-01,.$%E;)）、克魯維酵母（2()34$%-53,$"）、青霉（6$*’,’((’)5）、黑曲霉（!"#$%&’(()"［#I%］*’&$%）及無花果曲霉（!"#$%&’(()"7’,))5）等內(nèi)切菊粉酶基因的分子克隆。本文報(bào)道菊粉酶酶源菌株的篩選及其內(nèi)切菊粉酶基因的克隆和序列分析。!材料和方法!"!菊粉酶產(chǎn)生菌分離樣品菊芋根部土壤。!"#菊芋采自野生菊芋。!"$培養(yǎng)基!"$"!初篩培養(yǎng)基：菊粉"$J，蛋

4、白胨/$J，酵母膏/$J，瓊脂"$J，定容至/K。（菊粉單獨(dú)滅菌，加入已熔化并冷卻到1$L的瓊脂培養(yǎng)基中，混勻制平板）。!"$"#復(fù)篩培養(yǎng)基：菊芋/$J，酵母膏1J，氯化鈉1J，磷酸氫二鉀#J，;M%N$，定容至/K。!"$"$察氏培養(yǎng)基：按文獻(xiàn)［2］方法配制。!"$"%KO培養(yǎng)基：按文獻(xiàn)［@］方法配制。!"%菌種和質(zhì)粒+),-(’*=/$0、質(zhì)粒;?8//@購自日本寶生物工程（大連）有限公司。"通訊作者作者簡介：張苓花（/0123），女，遼寧省大連市人，大連輕工業(yè)學(xué)院教授，主要從事微生物和分子生物學(xué)教學(xué)及科研工作。收稿日期："$$/4$24"#，修回日期："$$/4/

5、/4"%>((微生物學(xué)報(bào)E(卷!"#試劑!"#提取液：在$%&’水中加入(%&’)%%&&*+,’-./0123（+4256%）和7&’)%%&&*+,’8!-#（4276%），加水定容至9%%&’。菊粉為0/:&;公司產(chǎn)品，!"#聚合酶、<3=產(chǎn)物回收試劑盒等購自日本寶生物工程（大連）有限公司。!"$菊粉酶酶源菌株的篩選!"$"!初篩：取分離樣品于無菌生理鹽水中，>%?，97%.,&/@振蕩>%&/@，按不同稀釋度涂布于初篩培養(yǎng)基上，培養(yǎng)(A>B，挑選透明圈直徑與菌落直徑之比較大的菌株。!"$"%復(fù)篩：初篩得到的菌株，接種于>%&’發(fā)酵培養(yǎng)基中，>%?，9)%.,&/

6、@搖床發(fā)酵，跟蹤測定菊粉酶活性，從中篩選高產(chǎn)菌株。［5］!"$"&菊粉酶活性測定：菊粉酶活性單位定義：42)C)、))?條件下每分鐘水解底物生成9還原糖所需的酶量為一個酶活單位。酶活性測定：以(D菊粉為底物，42EC$，!&*+)%?水解9)&/@，用>，)1二硝基水楊酸測定產(chǎn)生的還原糖量。［’］!"’菊粉酶酶源菌株的鑒定!"’"!菌落形態(tài)觀察：將待鑒定菌株涂布于察氏培養(yǎng)基平板上，(7?培養(yǎng)，(周內(nèi)跟蹤觀察菌落形態(tài)。鏡下形態(tài)觀察：在涂有察氏培養(yǎng)基的蓋玻片上接種待鑒定菌，置于培養(yǎng)皿中，加入甘油保濕，(7?培養(yǎng)，E天內(nèi)跟蹤觀察其鏡下形態(tài)。!"(菊粉酶基因克?。?%］!"("

7、!提取黑曲霉#F9%基因組"!#：#F9%活化后接種于(%%&’馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，(7?、9>).,&/@搖床培養(yǎng)(G，離心并洗滌菌絲體。無菌研缽中，用液氮將菌絲體迅速研磨成粉末狀。在9C)&’離心管中加入約%C9:菌體和)%%提取液，振蕩使之充分混!’!"#合，再加入9%%、氯化芐>%%，劇烈振蕩使管內(nèi)混合物成乳狀，在)%?保溫9G。!’9%DH!H!’然后加入>%%（<2)6(）混勻，冰水浴9)&/@，$%%%.,&/@離心9)&/@，收集上清!’>&*+,’";#3液。加入等體積無水乙醇室溫沉淀(%&/@。9%%%%.,&/@室溫