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1、安徽農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文哈茨木霉高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株的篩選及其基因的克隆姓名：王紅梅申請學位級別：碩士專業(yè)：生物物理學指導教師：蔣立科20090601中文摘要木霉(Trichoderma．．淵屬于半知菌類叢梗孢目，叢梗孢科真菌(Gloiosporae)是一種廣泛存在于土壤、植物根際和葉面的腐生型真菌，對多種植物病原真菌具有拮抗作用。因而被當作為一種生防菌種進行使用，并引起了眾多微生物學家和植物病害研究者的高度重視。一方面鑒于它能促進作物生長，另一方面因頻繁的生化作用的不穩(wěn)定性，迫使人們?nèi)ヌ骄吭?，以促進木霉菌在植物生防領(lǐng)域和促作物
2、生長上的開發(fā)利用，為實現(xiàn)促進木霉在生產(chǎn)應用上提供充分的生物學依據(jù)。幾丁質(zhì)是自然界廣泛存在的生物多聚體，是構(gòu)成大多數(shù)真菌細胞壁的主要成分，而有些微生物分泌的幾丁質(zhì)酶有降解幾丁質(zhì)的作用，而達到防治真菌的目的。很多年來，農(nóng)業(yè)和林業(yè)上遇到的病害很大部分都是由昆蟲和真菌引起的，不難發(fā)現(xiàn)，這兩大類有個重要的共同點，就是其外殼都是由幾丁質(zhì)組成的。所以，在發(fā)現(xiàn)了化學農(nóng)藥對環(huán)境和人類造成的不可彌補的重大災難后，人們把注意力朝向了生物防治，因而催化幾丁質(zhì)分解的主要酶——幾丁質(zhì)酶就自然地成了研究的重點。因此，不斷去尋找篩選產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的微生物，并純化
3、其所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶，研究其性質(zhì)、作用方式、作用效果及分子機理，以及轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因植物的研究發(fā)現(xiàn)，是目前生物防治研究中的一個新的熱點。本項研究主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：1．離子注入并篩選突變菌株：通過氮離子注入誘變哈茨木霉野生菌，再以透明圈法進行平板培養(yǎng)菌的初篩和復篩，DNS法測定液體培養(yǎng)菌的酶活，從中篩選出一株高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的菌株(編號為3．3)，確定為哈茨木霉新突變株(命名待定)。2．優(yōu)化篩選木霉菌株生長條件：對所篩菌株進行單因素和正交試驗發(fā)酵的條件優(yōu)化。單因素分別是從培養(yǎng)基氮源、膠體幾丁質(zhì)濃度、發(fā)酵起始pH值、培養(yǎng)時間等方面進行，
4、實驗結(jié)果表明，添加1％蛋白胨組的產(chǎn)酶量最高，1．0％膠體幾丁質(zhì)對菌體產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的誘導性最強，初始pH5．5、培養(yǎng)96h時產(chǎn)酶量較高；正交試驗綜合分析表明，哈茨木霉H-13接種于1％蛋白胨為氮源、0．5％膠體幾丁質(zhì)為碳源、初始pH5．0的培養(yǎng)基，培養(yǎng)96h時，發(fā)酵液中的幾丁質(zhì)酶活可達至U731．69U／mE，高于單因素條件中的任一因素，比野生菌株酶活力提高1倍。3．對突變菌株幾丁質(zhì)酶基因克?。汗哪久故侵匾纳谰瑢Χ喾N病原菌均有很好的拮抗作用，其作用之一就是產(chǎn)生多種細胞壁降解酶，尤其是42kD幾丁質(zhì)酶。根據(jù)GenBank上已
5、有的42kD幾丁質(zhì)酶編碼基因序列設(shè)計適宜的引物，通過PCR技術(shù)，從哈茨木霉H一13基因組DNA中擴增到相應序列，通過GenBank進行序列比對，發(fā)現(xiàn)該序列同已發(fā)表的其他Trichodermharzianum42kD幾丁質(zhì)酶序列具有99％的同源性，因此確定該序列為42kD幾丁質(zhì)酶編碼基因，堿基序列比對表明在編碼區(qū)內(nèi)有1l處堿基改變，導致6處氨基酸發(fā)生改變。4．進行了對所篩選菌株發(fā)酵產(chǎn)物的應用：在蚌埠懷遠所進行了大棚蔬菜種植實驗，其萵筍、番茄增長30％以上，水稻育秧狀況表現(xiàn)出較對照組的明顯旺盛。綜上可知，本研究首次采用離子注入誘變
6、的方法并獲得高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的木霉菌株，表明此方法的可行性，對于其發(fā)酵產(chǎn)物對植物增長的事實，為木霉在促進植物生長和生物防治方面的研究提供了支持和依據(jù)，幾丁質(zhì)酶基因的成功克隆，為轉(zhuǎn)基因植物的發(fā)展提供了理論依據(jù)。關(guān)鍵詞：哈茨木霉；氮離子注入；幾丁質(zhì)酶；產(chǎn)酶條件；基因擴增II英文摘要Trichoderma．SPPbelongstoclusterstemcohortofDeuteromycetes．Gloio．,poraefungus．ItisakindofgenerallyexistentFunguswhichisatypicalrot
7、fungianditisarlantagonisticbacteriumofAgaricusspawndistresspathogensinthesoil，plantrootzoneandleafsurface．Trichodermaisattractedbymanymicrobiologistsandlearnersforit’SbiocontrolfactorsOilplantdiseases，positiveeffectsonpromotingplantgrowthandinhibitplantdiseases．Itis
8、necessarytostudyTrichodermaforit’Susefulfacts．．Thechitinisakindofbiopolymerwidespreadexistenteinthenature，whichisprincipalingredientstomak
