黃綠木霉和球孢白僵菌幾丁質(zhì)降解酶基因的克隆與表達(dá)

《黃綠木霉和球孢白僵菌幾丁質(zhì)降解酶基因的克隆與表達(dá)》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。

1、摘要幾丁質(zhì)降解酶是一組能降解幾丁質(zhì)，生成幾丁低聚糖的酶的總稱。幾丁質(zhì)是由B—l，4糖昔鍵連接的N．乙酰氨基葡萄糖的多聚物，是儲量僅次于纖維素的第二大生物資源?；瘜W(xué)方法制各幾丁質(zhì)及其衍生物由于產(chǎn)生二次污染已經(jīng)逐漸被酶法取代，但由于幾丁質(zhì)降解酶傳統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)的成本高又不容易獲得單一酶組分，使得酶法難于推廣，因此生產(chǎn)廉價的幾丁質(zhì)降解酶成為解決這一問題的癥結(jié)。本研究通過基因工程的方法克隆幾丁質(zhì)降解酶基因，轉(zhuǎn)入釀酒酵母中，為大量生產(chǎn)幾丁質(zhì)降解酶奠定基礎(chǔ)。黃綠木霉(Trichodermaaureoviride)和球孢白僵菌(Beauveriabas

2、siana)是自然界普遍存在的真菌，具有高效的幾丁質(zhì)降解酶體系。本論文以黃綠木霉(zaureoviride)和球孢白僵菌(B．bassiana)為出發(fā)菌株：采用PCR方法克隆到黃綠木霉(zaureoviride)和球孢白僵菌(B．bassiana)幾丁質(zhì)降解酶基因eeh42、chitl、chit2和cnslDNA片段，測序后將這些基因DNA片段構(gòu)建到釀酒酵母(&cerevisiae)誘導(dǎo)型表達(dá)載體pYES2上，轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)化子經(jīng)誘導(dǎo)，用Northern雜交驗證了目的基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。采用DNS法．分別以膠態(tài)幾丁質(zhì)為底物，研究了各個轉(zhuǎn)化子

3、的酶活性、培養(yǎng)周期，重組酶的最適溫度和pH值，以及重組酶的協(xié)同作用。本論文從黃綠木霉(raureoviride)和球孢白僵菌(B．bassiana)菌株的DNA中，通過引物設(shè)計，用PCR方法克隆得到了ech42、chitl、chit2、cnsl的DNA片段，共4個基因片段。對其中的DNA片段進行測序，證實得到了全部是幾丁質(zhì)降解酶基因的DNA片段。采源于黃綠木霉的幾丁質(zhì)酶基因ech42序列遞交國際權(quán)威基因數(shù)據(jù)庫GenBank，經(jīng)審核確認(rèn)沒有與數(shù)據(jù)庫中重復(fù)的序列后，將該序列在數(shù)據(jù)庫上發(fā)表，序列號為AY850032。添補了國際權(quán)威基因數(shù)據(jù)庫

4、GenBank在黃綠木霉幾丁質(zhì)酶基因這一內(nèi)容上的空白。將克隆到的4個目的基因構(gòu)建到帶有高效啟動子的釀酒酵母表達(dá)載體pYES2上，得到4個重組質(zhì)粒。用釀酒酵母完整細(xì)胞轉(zhuǎn)化法將以上4個重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入釀酒酵母(scerevisiae)H158細(xì)胞中，通過釀酒酵母菌落PCR和雙酶切鑒定證實了轉(zhuǎn)化的成功，得到了帶有4種幾丁質(zhì)降解酶基因DNA片段的釀酒酵母(Scerevisiae)H158轉(zhuǎn)化子。對轉(zhuǎn)化子的Northern雜交檢測分別得到了與預(yù)期大小相符的雜交信號哈爾濱工業(yè)大學(xué)工學(xué)博士學(xué)位論文帶，證實了各個幾丁質(zhì)降解酶基因DNA片段在GALl啟動子

5、控制下經(jīng)半乳糖誘導(dǎo)在釀酒酵母(scerev括iae)中成功轉(zhuǎn)錄表達(dá)；并通過DNS法研究了各個轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵周期，發(fā)現(xiàn)ech42、chitl、chit2和cnsl轉(zhuǎn)化子產(chǎn)酶高峰的出現(xiàn)時間分別為36h、48h、36h和48h(接種量為5mL)，各轉(zhuǎn)化子酶活的最大值分別為0．50、0．47、0．63、和0．62UmL～；各重組酶的最適反應(yīng)溫度分別為Ech4240℃、Chitl70℃、Chit270℃、Cnsl70℃；各重組酶的最適pH值分別為Ech428．0、ChRl8．0、Chit25．0、Cnsl4．6。比較了在相同條件下4種轉(zhuǎn)化子分泌的

6、重組酶的協(xié)同作用，結(jié)果表明在相同條件下4種重組酶不同組合的酶活差異十分顯著。在所有的組合當(dāng)中，Cnsl和chitl組合的酶活最高0．75UmL～，Chitl和Chit2組合酶活最低0．21UmL一。重組酶Ech42和Cnsl與其它重組酶之間存在正協(xié)同效應(yīng)，Chitl和Chit2之間是負(fù)協(xié)同效應(yīng)。黃綠木霉(Zaureoviride)和球孢白僵菌(Bbassiana)的幾丁質(zhì)降解酶基因DNA片段的克隆，為進一步研究幾丁質(zhì)降解酶基因在釀酒酵母(Scerevisiae)等其他細(xì)胞中的表達(dá)及重組酶的特性提供了重要的材料：為其他有關(guān)抗病抗蟲基因工

7、程提供了重要基因資源。通過對轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵周期和重組酶的酶學(xué)特性分析證實了釀酒酵母(Scerevisiae)可以正確表達(dá)黃綠木霉(Taureoviride)和球孢自僵菌(B．bassiana)的幾丁質(zhì)降解酶基因的DNA片段，為構(gòu)建可大量生產(chǎn)幾丁質(zhì)降解酶的酵母工程菌提供了重要理論依據(jù)。實驗中四種幾丁質(zhì)降解酶存在不同的協(xié)同作用的結(jié)果，為進一步研究其他不同的幾丁質(zhì)降解酶組合的協(xié)同作用提供了新的思路，對進一步研究，L丁質(zhì)降解酶的實際應(yīng)用具有重要的意義。關(guān)鍵詞黃綠木霉；球孢白僵菌；幾丁質(zhì)降解酶基因；釀酒酵母；克隆與表達(dá)AbstractChitin

8、olyticenzymesareaheterogeneousgroupofenzymesthatcatalysethehydrolyticdepolymerisationofchitin，whichislongchain