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《棘孢木霉菌幾丁質酶基因的克隆表達及酶學性質分析.pdf》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在工程資料-天天文庫。
1、萬方數據Cloning，ExpressionandEnzymeCharacterizationAnalysisofChitinaseGenefromTrichodermaasperellumThesissubmittedtoO物daoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequire：mentfortheDegreeofMasterofScienceCongDaPeng(CollegeofLifeScience)Supervisor：XianHongquanQing
2、dao．ChinaJune，2012萬方數據獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的論文是我個人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得青島農業(yè)大學或其它教育機構的學位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。研殼生簽名：左盔火砷烏時間：工侈7游莎月；陽關于論文使用授權的說明本人完全了解青島農業(yè)大學有關保留、使用學位論文的規(guī)定，即：學校有權保留送交論文的復
3、印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編學位論文。同意青島農業(yè)大學可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學位論文的全部或部分內容。(保密的學位論文在解密后應遵守此協議)時間：>。，L年多月多勺日時間：沙7L年易月雩伊阻略靶久限終成名簽生幣修導萬方數據青島農業(yè)大學碩士學位論文摘要木霉菌作為一種生防菌，在生物防治中占有極其重要的地位，在其重寄生過程中產生的幾丁質酶能夠降解多種病原菌細胞壁。幾丁質酶普遍存在于各種動物、植物和微生物中，在醫(yī)藥、食品、環(huán)保、生防等許多領域顯示出廣闊的
4、應用前景。國內外已經篩選出多種幾丁質酶產生茵，并將其進行分離純化。但只有部分在實際中得到應用，主要原因是菌株的產酶能力較低。因此克隆幾丁質酶基因、實現其高效表達是解決問題的一條重要途徑。本文根據幾丁質酶基因序列保守區(qū)設計簡并引物、再根據克隆到的幾丁質酶基因片段序列設計特異性引物，運用RT．PCR、RACE．PCR、TAIL．PCR技術，從木霉菌Td3104中克隆出完整的幾丁質酶基因tachi2。全長DNA序列為1447br,，閱讀框架(ORF)位于31～1364位核苷酸之間，包含2段內含子序列，編碼397個氨
5、基酸。該基因DNA序列已提交GenBank，登錄號為JF309106。利用DNAMAN軟件對木霉菌Td3104幾丁質酶的分子量、等電點、疏水性和親水性等性質進行了分析，同時還預測了其二級結構，結果顯示該蛋白的分子量為44．482kDa，等電點為5．67。分別將幾丁質酶基因tachil和tachi2與原核表達載體pEHisTEV融合，構建了表達載體pEHisTEV／tachil和pEHisTEV／tachi2，將重組表達質粒pEHisTEV／tachil和pEHisTEV／tachi2分別轉化BL21感受態(tài)細胞
6、，經過PCR檢測及篩選，轉化子進行IPTG誘導培養(yǎng)，獲得了以包涵體形式高效表達的Tachil和Tachi2。包涵體經洗滌、溶解、復性和純化后獲得了高純度的Tachil和Tachi2。復性后的Tachil和Tachi2具有較高的幾丁質酶活性，收集幾丁質酶蛋白，進行SDS．PAGE電泳，得出重組蛋白Tachil和Tachi2的分子量都約為44kDa。幾丁質酶Tachil最適反應溫度是35℃，最適反應pH值為6．0。Tachil凡丁質酶的穩(wěn)定性測定結果表明，酶液在30℃以下溫度處理1h，酶性質穩(wěn)定；在pH5-9條件
7、下處理1h，活性變化不明顯。K+金屬離子對酶活力有明顯的激活作用，而Zn2+、Cu2+、M92+等對該酶有明顯的抑制作用。幾丁質酶Tachi2的最適溫度為40。C，最適pH值為7．0，在pH6．8時酶活性質較穩(wěn)定；Mn2+、Fe2+對表達幾丁質酶有激活作用，其中Mn2+的激活作用最明顯，Fe2+次之；Cu2+、Zn2+等對表達幾丁質酶有顯著的抑制作用；而K+、Nr對酶活性影響不大。關鍵詞：棘孢木霉；幾丁質酶；基因克?。槐磉_；純化；復性；酶學性質萬方數據青島農業(yè)大學碩士學位論文AbstractTrichoder
8、maisanimportantbiocontrolfungztswhichproducesvariouschitinasetOdegradethecellwallofthefungalpathogensintheprocessofhyperparasitization．Chitinaseexistinallkindsofanimals，plantsandmicroorganismsgenerally
