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《暗黑鰓金龜幾丁質(zhì)酶基因hpchi的克隆、表達(dá)及活性分析》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、萬方數(shù)據(jù)分類號：Q窆魚魚密級：公玨單位代碼：!QQ墨魚學(xué)號：2Q!QQ窆墨暗黑鰓金龜幾丁質(zhì)酶基因細(xì)劬z的克隆、表達(dá)及活性分析Genecloning、expressionandactivityanalysisofchitinasehpChifromHolotrichiaparallelaMotschulsky(Coleoptera：Scarabaeoidea)學(xué)位申請人：鄒爽指導(dǎo)教師：郭巍教授學(xué)科專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)位類別：理學(xué)碩士授予單位：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)答辯日期：二。一四年五月三十日萬方數(shù)據(jù)獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指
2、導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得塑皇堡塞些盤堂或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名：勾短簽字日期：刃f年年鄉(xiāng)月／日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解泣皇墾盔些盤堂有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)塑皇堡壘些盤堂可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)
3、據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。(保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書1學(xué)位敝儲繇鍛簽字日期：矽／年年／月日學(xué)位論文作者畢業(yè)后去向：工作單位：通訊地址：導(dǎo)師簽名：卻象簽字日期：力，々年<月I電話：郵編：萬方數(shù)據(jù)摘要幾丁質(zhì)(chitin)是N．乙酰氨基葡萄糖的同聚物，在昆蟲生長發(fā)育的各個(gè)時(shí)期，幾丁質(zhì)的含量和分布都需要相應(yīng)發(fā)生變化。幾丁質(zhì)酶(chitinase)屬水解酶類，能夠?qū)锥≠|(zhì)長鏈降解為寡聚物。昆蟲幾丁質(zhì)酶存在于昆蟲的中腸、蛻皮液及某些昆蟲的毒腺中，表達(dá)水平隨昆蟲不同生長發(fā)育階段而變化，對昆蟲幾丁質(zhì)的代謝起
4、重要調(diào)控作用。為了得到鞘翅目特異性幾丁質(zhì)酶基因，本研究免疫篩選已構(gòu)建的暗黑鰓金龜(HolotrichiaparallelaMotschulsky)中腸cDNA表達(dá)文庫，得到暗黑鰓金龜幾丁質(zhì)酶基因，命名為hpChi，并對其特性進(jìn)行分析。hpChi基因全長1591bp，開放讀碼框(ORF)1443bp，編碼480個(gè)氨基酸，預(yù)測的分子量大小為51．4kDa，等電點(diǎn)(pI)為5．08。氨基酸序列分析顯示其具有3個(gè)區(qū)域組成的多功能區(qū)結(jié)構(gòu)，分別為N．端的酶活性催化區(qū)(catalyticdomain)，C．端富含半胱氨酸的幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)(chitin-bind
5、ingdomain，CBD)及富含絲氨酸和蘇氨酸的連接區(qū)(Linker)。利用PDB網(wǎng)站對HpChi蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，表明HpChi蛋白具有幾丁質(zhì)酶第18家族(Family18)典型的“(fJ／Q)8圓桶型結(jié)構(gòu)”。利用NCBI網(wǎng)站和MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示暗黑鰓金龜幾丁質(zhì)酶HpChi與近緣種的華北大黑鰓金龜親緣關(guān)系最近，其次與直翅目東亞飛蝗(Locustamigratoriam冊ilensis)和鞘翅目赤擬谷盜(THbo矗umcastaneum)親緣關(guān)系較近，與鞘翅目昆蟲黃粉蟲(Tenebriomolitor)、墨松天牛(Mono
6、chamus口，f繃口觚)、辣根猿葉甲(PhaedoncDchle口riae)統(tǒng)屬一大類，與膜翅目和鱗翅目昆蟲親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。構(gòu)建原核重組表達(dá)載體pET30a—hpChi，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。誘導(dǎo)表達(dá)并優(yōu)化表達(dá)條件，經(jīng)SDS．PAGE電泳和WesternBlot分析，成功表達(dá)分子量51．4kDa的幾丁質(zhì)酶蛋白，與預(yù)測結(jié)果相符。將以包涵體形式存在的外源蛋白HpChi超聲破碎后，通過Ni+-NTA樹脂親和層析純化蛋白，并制備多克隆抗體。構(gòu)建重組酵母表達(dá)載體pPICK9K．hpChi，轉(zhuǎn)化缺陷性畢赤酵母GSl15，經(jīng)抗性篩選、表型和分子鑒定表明重組酵
7、母GSll5(pPICK9K．hpChi)構(gòu)建成功。但甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后，WesternBlot檢測未能成功表達(dá)目的蛋白。構(gòu)建真核(重組桿狀病毒)表達(dá)載體pFast．@chi，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHl0Bac，利用其載體自帶質(zhì)粒轉(zhuǎn)座將目的基因插入Bacmid桿狀病毒進(jìn)一步構(gòu)建得到Bacmid．@chi。轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞(草地貪夜蛾細(xì)胞系sf9)，分別獲得P1、P2、P3病毒，取上清進(jìn)行WesternBlot檢測，證明HpChi在昆蟲細(xì)胞sf9中獲得成功表達(dá)。以幾丁質(zhì)為底物通過DNS比色檢測還原糖的原理測定細(xì)胞表達(dá)的幾丁質(zhì)酶的酶活，結(jié)果顯示其有幾丁質(zhì)酶的活性并
8、且在微酸環(huán)境下活性較強(qiáng)。本研究通過對暗黑鰓金龜幼蟲(蠐螬)幾丁質(zhì)酶生物信息學(xué)分析和活性測萬方數(shù)據(jù)定，為深入了解鞘翅目昆蟲幾丁質(zhì)酶生物學(xué)功能提供理論依據(jù)
