人參CLASSⅢ幾丁質(zhì)酶基因克隆、序列分析及原核表達(dá)

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1、吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文人參CLASSⅢ幾丁質(zhì)酶基因克隆、序列分析及原核表達(dá)姓名：孫炳欣申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：植物病理學(xué)指導(dǎo)教師：李玉;李海燕20060501吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文人參cLAssITI幾丁質(zhì)酶基固克隆、序列分析及原植表達(dá)人參CLAsSIII幾丁質(zhì)酶基因的克隆、序列分析及原核表達(dá)摘要幾丁質(zhì)(8一1．4．乙酰葡萄糖胺線形同聚物)是病原真菌細(xì)胞壁的主要成分，幾丁質(zhì)酶通過(guò)破壞病原真菌菌絲尖端新合成的幾丁質(zhì)，使病原真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)降解；破壞細(xì)胞新物質(zhì)的沉積，致使病原體死亡，且所產(chǎn)生的細(xì)胞壁碎片具有誘導(dǎo)物作用，可激發(fā)寄主

2、植物的抗病反應(yīng)。植物幾丁質(zhì)酶具有廣泛的生理活性，尤其在植物抗病性方面具有重要作用，植物幾丁質(zhì)酶基因工程成為目前抗真菌基因工程研究熱點(diǎn)之一一。本文以人參為材料，首次從中克隆了ClassIII幾丁質(zhì)酶基因，并進(jìn)行了序列分析，研究了該基因在大腸桿菌中的表達(dá)情況，其主要結(jié)果如下：1．通過(guò)RT—PCR與反向PCR方法，從人參中克隆到一個(gè)ClassIII幾丁質(zhì)酶基因，并進(jìn)行測(cè)序，全長(zhǎng)為1432bp，其中包含完整的開放閱讀框即從第272位的起始密碼子到第1169位的終止密碼子，推測(cè)編碼蛋白的氨基酸序列含298個(gè)氨基酸殘基，無(wú)內(nèi)含子，并在GenBa

3、nk上注冊(cè)(D0532359)；2人參ClassⅡI幾丁質(zhì)酶基因與其它植物classIII幾丁質(zhì)酶基因在核苷酸和氨基酸水平上有很高同源性；通過(guò)對(duì)人參CIassIII幾丁質(zhì)酶基因的系統(tǒng)發(fā)育樹分析得出，人參ClassIII幾丁質(zhì)酶和其它植物的C1assIII幾丁質(zhì)酶具有共同的起源；ClassI、ClassII和classⅣ幾丁質(zhì)酶來(lái)源于同一祖先，而classIII與classV幾了‘質(zhì)酶來(lái)源于同一祖先。3．人參ClassIII幾丁質(zhì)酶基因編碼一酸性幾丁質(zhì)酶，等電點(diǎn)pI為4．55，預(yù)測(cè)分子量為31．4KD；人參classIII幾丁質(zhì)酶氨基

4、酸序列含有兩個(gè)功能區(qū)域即N_端信號(hào)肽區(qū)和糖基水解酶18家族催化區(qū)；人參ClassIII幾丁質(zhì)酶蛋白的催化區(qū)內(nèi)，144—152為幾丁質(zhì)酶18家族的活性位點(diǎn)，序列為L(zhǎng)DGⅥ)H)Ⅲ，活性中心為E(GIu)；人參ClassIⅡ幾丁質(zhì)酶蛋白的成熟位點(diǎn)在第25—26的Ala—G1v之問；4用同源建模法模擬出人參CIassIⅡ幾丁質(zhì)酶的空間結(jié)構(gòu)模型；5將人參ClassIlI幾丁質(zhì)酶基因亞克隆到大腸桿菌的表達(dá)載體pET．28a(+)中，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，SDS．PAGE分析初步表明幾丁質(zhì)酶以包涵體的形式表達(dá)。關(guān)鍵詞：人參，幾丁質(zhì)酶基因，序

5、列分析，原核表達(dá)童堡查些查蘭墮主蘭竺笙壅△查!些!!旦些工墮壁莖里塞堡：壁!!坌燮塑：查竺一Cloning，SequenceAnalysisandProkal了oticExpressionofCLASSⅢChitinaseGeneFrom，k以nx砌韶略AbstractChitin(alinearpolysaccharideofB—l，4—1inkedN-acetylgucosalnineresidues)isamajorconstituelltofpathogcnicfungalcdlwau．Chitinasedes仃oysdle

6、syl汕esisofchidn0nt11etopoffungalmycelium，des咖ctsdeposm徹ofnewma婦jalincenandtllenleadspamogenydcad．Andtlledebrisofcellwallcanstinlulateant卜diseaserespondOfhostasanmductorPlantchibnasesexhibitphysiologicactivitiesinmanywaysandpanicularb，playsaimportantroleinthediseasercsi

7、stanceofp1孤tPlaIltchitinaseis0neofhotpojntsinpIalltgeneticengineersoffungalresist卸ce．Inthisthcsis，aClassⅡIchi6nasegeIle0fAm刪g鞏se耀啪sflrstcoloncd，sequencedandaHaly捌．BKprcssionofchidnasegenehasbeenstudiedlAnovelCIassⅡIchmnasegelleofR掰甜∥聊慪wasdonedbyRT-PCRa芏ldInVersePCR．Th。

8、full-lengthgenomicsequenceof1432bp0fthcClassⅡIchi缸nascgenewassequcnced．Allenthopenreadingfr詛me(ORF)of298a11inoacidswa