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《轉(zhuǎn)化生長因子β1 基因?qū)撬杌|(zhì)干細(xì)胞增殖分化的影響》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、轉(zhuǎn)化生長因子β1基因?qū)撬杌|(zhì)干細(xì)胞增殖分化的影響【關(guān)鍵詞】骨髓細(xì)胞關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)化生長因子β1;骨髓細(xì)胞;干細(xì)胞;轉(zhuǎn)染摘要:目的觀察轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）基因能否轉(zhuǎn)入骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（MSCs），并探討經(jīng)TGF-β1基因轉(zhuǎn)染后的MSCs增殖和分化情況.方法取新西蘭雄性大耳白兔的骨髓，得骨髓源MSCs體外培養(yǎng).將重組TGF-β1和空載pcD-NA3基因分別轉(zhuǎn)染MSCs后，免疫組化（SABC）法檢測TGF-β1轉(zhuǎn)染是否成功，用透射電鏡和流式細(xì)胞儀觀察兩組MSCs的增殖和分化情況.結(jié)果SABC法證明TGF-β1瞬間轉(zhuǎn)染成功;轉(zhuǎn)染48h后，實(shí)驗(yàn)組MS
2、Cs增殖較對照組顯著;實(shí)驗(yàn)組MSCs具有一定的分化趨勢.結(jié)論重組TGF-β1基因轉(zhuǎn)入骨髓源MSCs的方法是可行的，瞬間TGF-β1轉(zhuǎn)染對MSCs的增殖和分化有顯著促進(jìn)作用. Keyinggroarrocells;transfection Abstract:AIMToinvestigateinggroesenchymalstemcells（MSCs）andifitcanbe，thentoob-servetheeffectofthesuccessfulrebinantTGF-β1genetransferonMSCs.METHODSAdultmale
3、Neultiplica-tionanddifferentiationofMSCsetryandtransilluminatingelectronmicroscopeandthe positiveexpressionofTGF-β1munohis-tochemicalstaining（SABC）.RESULTSTransferultiplificationinMSCs-berincreasedobviouslyandthedifferentiationofMSCsissig-nificant. 0引言 轉(zhuǎn)化生長因子β1（Transformingg
4、roo齡新西蘭雄性大耳白兔1只，2.0kg（第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供）;DEME培養(yǎng)液（Gibco）;胎牛血清（浙江金華清胡犢牛利用研究所）;胰蛋白酶（Sigma）;CO2培養(yǎng)箱（美國scien公司）;倒置顯微鏡（olympus）;淋巴（Ficoll）分離液（密度1.077）;TGF-β1免疫組化試劑盒（購自博士德公司）;流式細(xì)胞儀（FCM）檢測細(xì)胞周期，透射電鏡（TEM）觀察. 1.2方法 1.2.1MSCs的分離培養(yǎng)將新西蘭大耳白兔于耳緣iv250mLL-1烏拉坦2mLkg-1麻醉致死.無菌條件下取股骨骨髓;Ficoll分離液反復(fù)沖洗吹打，
5、20min，2000rmin-1離心兩次，取中間乳白色的有核細(xì)胞層;用DEME培養(yǎng)液洗滌，并吹打成細(xì)胞懸液;接種于50mL培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入pH7.3的DEME培養(yǎng)基5mL.置入37℃，50mLL-1CO2孵育箱中孵育. 1.2.2實(shí)驗(yàn)分組將第2代MSCs接種6孔培養(yǎng)板中的2孔內(nèi)，孔內(nèi)均預(yù)置蓋玻片1片，并同時(shí)傳代于6瓶50mL培養(yǎng)瓶中.當(dāng)細(xì)胞生長至70%～80%融合時(shí)，按標(biāo)準(zhǔn)方法以3μLLipofectamine介導(dǎo)的1μLpcD-NA3-TGF-β1重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入3瓶細(xì)胞和1孔培養(yǎng)板中的MSCs，為實(shí)驗(yàn)組.其余均為對照組，僅轉(zhuǎn)入1μLpcDNA3
6、空載體. 1.2.3TGF-β1基因轉(zhuǎn)染的瞬時(shí)表達(dá)48h后取出兩孔細(xì)胞爬片，SABC法檢測瞬時(shí)表達(dá)情況，各組用1瓶細(xì)胞在透射電鏡下觀察，其余兩瓶細(xì)胞和培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞用流式細(xì)胞儀以488nm氬激光檢測細(xì)胞周期.數(shù)據(jù)處理:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較用t檢驗(yàn). 2結(jié)果 2.1TGF┐β1基因轉(zhuǎn)染瞬間表達(dá)SABC法顯示轉(zhuǎn)染48h后，大部分TGF-β1基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞漿內(nèi)充滿棕色顆粒，pcDNA3空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞對照組則為陰性（Fig1，2）. 2.2TGF┐β1基因轉(zhuǎn)染對MSCs增殖的影響試驗(yàn)組S期細(xì)胞DNA含量顯著高于對照組，G0/G1期細(xì)胞DNA的
7、含量相對減少（Tab1）. 表1轉(zhuǎn)染后48hMSCs各細(xì)胞周期DNA含量比較 略 2.3TGF┐β1基因轉(zhuǎn)染對MSCs定向分化的影響TGF-β1基因轉(zhuǎn)染MSCs功能活躍，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多、擴(kuò)大，胞質(zhì)內(nèi)有豐富的核糖體、脂滴、線粒體和溶酶體及中等電子密度的無定形物，細(xì)胞核常染色質(zhì)豐富，核仁清晰.空載體轉(zhuǎn)染MSCs胞漿內(nèi)亦有豐富的細(xì)胞器，但粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體明顯少于實(shí)驗(yàn)組MSCs（Fig3，4）. 圖1－圖4略 3討論 許多組織中的間充質(zhì)前體細(xì)胞的數(shù)量和增殖活性很高，具有向軟骨分化的潛能.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）由于易于獲取并能應(yīng)用這些細(xì)胞在體
8、內(nèi)修復(fù)弱骨缺損而引起研究者們極大興趣.但體外培養(yǎng)時(shí)MSCs的分化機(jī)制較為復(fù)雜，不同細(xì)胞因子和培養(yǎng)條件對其的影響不同，而TG
