植物雌激素對去勢雌大鼠缺血腦組織c fos表達(dá)的影響

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1、植物雌激素對去勢雌大鼠缺血腦組織Cfos表達(dá)的影響【關(guān)鍵詞】腦缺血植物雌激素類Cfos細(xì)胞凋亡0引言研究表明,cfos基因表達(dá)與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，Cfos表達(dá)的強(qiáng)弱與缺血狀態(tài)下的組織細(xì)胞損傷的程度正相關(guān).我們通過觀察動物雌激素和植物雌激素對去勢雌大鼠永久的局灶腦缺血后不同時間段的Cfos表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討植物雌激素對缺血腦組織的保護(hù)機(jī)制.我們應(yīng)用葛根素作為植物雌激素的代表，它的化學(xué)結(jié)構(gòu)是8D吡喃葡萄糖4，7二羥基異黃酮苷，屬植物雌激素中異黃酮類.1材料和方法1.1材料動物雌激素選用美國Sigma公司的17Beta雌二醇，葛根素由山東魯銀制藥有限公司生產(chǎn)，C

2、fos多克隆抗體及Cfos蛋白免疫組化試劑盒和DAB染色劑購自武漢博士德生物制劑公司.1.2方法1.2.1模型建立成年雌性SD大鼠90只，3~4mo齡，體質(zhì)量230～260g,購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心.所有動物制作腦缺血模型前1L/kg).然后用改良的Loga［1］法行永久性右側(cè)大腦中動脈阻斷模型.動物隨機(jī)分成3組：空白對照組，雌激素組，葛根素組，每組30只.雌激素組腹腔注射17Beta雌二醇1g/kg)，葛根素組腹腔注射葛根素1g/kg),空白對照組不給予任何藥物.1.2.2標(biāo)本采集3組大鼠按大腦中動脈阻斷的時間各分為8h組，16h組，24h組.在相應(yīng)時間點將大鼠斷

3、頭取腦，將腦組織切除腦干，其余腦組織冠狀平均切成5等分，取中間的切片（約距額極4~7mm）.然后用40g/L的多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，石蠟包埋，制成蠟塊，切成厚約4μm的薄片.1.2.3標(biāo)本檢測ABC免疫組化法檢測Cfos蛋白的表達(dá).切片常規(guī)脫臘至水，滅活內(nèi)源性酶，熱抗原修復(fù)滴加1∶100稀釋的兔抗Cfos抗體，4℃過夜，滴加生物素化羊抗兔IgG，滴加試劑SABC，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染.Cfos陽性細(xì)胞計數(shù)方法：在各樣本相同部位，在缺血側(cè)梗死灶邊緣區(qū)選擇5個不重疊的視野，計數(shù)每個視野下每100個細(xì)胞中陽性染色的細(xì)胞數(shù).然后再除以5，所得的數(shù)據(jù)作為一個標(biāo)本的Cf

4、os表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù).統(tǒng)計學(xué)處理：上述數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS10.0統(tǒng)計軟件處理，用x±s表示，采用多因素方差分析方法進(jìn)行顯著性檢驗.2結(jié)果不同預(yù)處理組在永久的右側(cè)的大腦中動脈阻斷后8，16，24h三個時間點缺血腦組織都有大量的Cfos的表達(dá)，陽性細(xì)胞廣泛分布在缺血側(cè)的新皮層、遠(yuǎn)離梗死灶的海馬、扣帶回及部分丘腦.梗死灶中心未見陽性表達(dá)，梗死灶周圍的半暗帶區(qū)有較強(qiáng)的表達(dá)，未見缺血側(cè)紋狀體區(qū)域有Cfos蛋白的表達(dá).在腦缺血后8h,對照組,雌激素組和葛根素組Cfos陽性細(xì)胞數(shù)分別是20.3±0.8，19.4±0.6，和19.6±0.5,對照組與用藥組之間兩兩比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P

5、＞0.05).而對照組Cfos陽性細(xì)胞數(shù)在缺血后16h達(dá)高峰(40.9±1.3)，與8h相比差異顯著（P<0.05）.雌激素組和葛根素組在16h時Cfos陽性細(xì)胞數(shù)與8h時相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義.16h,雌激素組和葛根素組相比,Cfos陽性細(xì)胞數(shù)分別是21.3±1.0和21.4±0.6,差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05).在24h時間點，對照組Cfos陽性細(xì)胞數(shù)與16h相比略有減少，為32.9±1.27，而雌激素組和葛根素組Cfos的表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)分別是24.3±1.5和23.5±1.0,與16h時間點相比稍有增多.在16h及24h時間點,兩處理組與對照組相比，

6、Cfos的表達(dá)明顯減弱（P<0.05），而雌激素組和葛根素組之間相比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義.各處理組不同時間點Cfos蛋白的表達(dá)見圖1.3討論　　腦缺血后形成腦梗死的過程中，細(xì)胞發(fā)生了兩種方式的死亡：即梗死中心的急性細(xì)胞死亡和梗死周邊A：腦缺血后8h;B：對照組腦缺血后16h;C：雌激素組和葛根素組腦缺血后16h;D：對照組腦缺血后24h;E：雌激素組和葛根素組腦缺血后24h.圖1各組動物腦缺血后不同時間點梗死周圍半暗帶區(qū)Cfos蛋白的表達(dá)半暗帶區(qū)的細(xì)胞凋亡.后者的發(fā)生需要時間和能量的動態(tài)過程，它的發(fā)生較壞死緩慢，持續(xù)時間長.即刻早基因cfos基因正是與這一過程相關(guān)的

7、一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子.Cfos基因表達(dá)的機(jī)制是通過N甲基D天冬氨酸（NMDA）受體介導(dǎo)的，并隨谷氨酸釋放的增多而上升［2］.另外細(xì)胞內(nèi)鈣離子的增加，也可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞cfos的表達(dá).而已有研究證實17beta雌二醇可通過NMDA受體，抑制谷氨酸的釋放，并可減少神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)興奮性氨基酸的含量.另外它還可抑制鈣超載.因此，推測雌激素可通過上述途徑下調(diào)cfos基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞的凋亡，本實驗表明雌激素發(fā)生作用的主要部位是在非梗死區(qū)的扣帶回皮層.　　早在1991,就有學(xué)者報道大鼠（雌、雄）局