杜仲葉中綠原酸的提取研究

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　　杜仲葉中綠原酸的提取研究劉軍海，任惠蘭，裘愛泳【摘要】　　目的研究以丙酮為溶劑提取杜仲葉綠原酸的最佳工藝條件。方法通過單因素實驗研究各因素對提取率的影響，應(yīng)用正交實驗優(yōu)化工藝條件。結(jié)果丙酮提取杜仲葉綠原酸最佳工藝條件為：丙酮濃度40%，提取溫度65℃，料液比1∶13，提取時間2h，提取兩次。結(jié)論在最佳條件下，綠原酸提取率和得率分別為2.25%，17.15%，純度達(dá)到13.12%。【關(guān)鍵詞】綠原酸；提取；杜仲葉；丙酮　　Abstract：ObjectiveTheextractiontechnologyofchlorogenicacidfromEumiaulmoidesleaftheleavesofEumiaulmoidesents,andthentheoptimizedconditionsfortheextractionofchlorogenicacidizedconditionsperature65℃;materialtosolvent1:13,extractiontime3h,andextractiontizedconditions.　　KeylaUlmoides；Acetone 綠原酸是植物體在有氧呼吸過程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生的一種苯丙素類化合物〔1〕。綠原酸是一種具有廣泛生理活性和藥理活性的物質(zhì)，具有利膽、抗菌、降壓、增加白血球及興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)、抗腫瘤、降脂、清除自由基等多種藥理作用，對消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)疾病均有顯著療效〔1～6〕。因此，綠原酸在醫(yī)藥制劑上應(yīng)用越來越廣泛，是目前國際公認(rèn)的“植物黃金”。綠原酸主要存在于杜仲、金銀花、葵花籽粕、元寶楓等植物中〔7，8〕。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，杜仲葉Eumiaulmoidesleaves中含有較高的綠原酸，其葉中含量為1%～5.5%〔9，10〕。杜仲是我國的特殊經(jīng)濟林，在我國栽培面積相當(dāng)廣泛，全國約有杜仲林28萬ha，每年可產(chǎn)葉400萬噸〔11〕，而杜仲葉的利用率僅占可采集葉的10%～20%。因此利用杜仲葉生產(chǎn)綠原酸具有巨大的社會效益和經(jīng)濟意義。 　　在中草藥有效成分提取過程中，常用乙醇為溶劑。我們在提取杜仲葉綠原酸研究中發(fā)現(xiàn)，乙醇提取雖然得率相對較高，但在提取過程中醇溶性蛋白質(zhì)、黏液、樹脂、鞣質(zhì)、色素、油脂等雜質(zhì)析出量大，過濾較困難，尤其是當(dāng)溶劑中含水量高時更加明顯，同時給以后的分離純化工序造成很大困難。因此有必要尋找更好的提取劑提取。綠原酸屬酚酸類化合物〔12〕，也屬植物多酚類物質(zhì)〔13〕。有資料報道〔14〕，丙酮和丙酮-水體系對植物多酚具有很強的溶解性，而且用丙酮提取杜仲葉中主要活性成分的工藝未見文獻(xiàn)報道。本實驗采用丙酮-水體系對杜仲葉中綠原酸提取工藝進(jìn)行研究。　　1器材與方法　　1.1材料與儀器杜仲葉，購于北京某地區(qū)，為初秋采集葉。綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品和生物制品鑒定所）；丙酮、正丁醇、冰乙酸均為分析純（上海試劑公司）；實驗用水為去離子水。Unic-2100型紫外可見光分光光度計（上海龍尼柯儀器有限公司）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；365nm紫外分析儀（上?？扑嚬鈱W(xué)儀器廠）；SHZ-III循環(huán)水多用真空泵（上海亞榮生化儀器廠）?！　?.2方法　　1.2.1杜仲葉中綠原酸含量的測定采用紙層析-紫外分光光度法〔15〕?！　?.2.2提取單因素實驗隨機稱取5g干燥的杜仲葉粉（20目），置于250ml平底燒瓶中，采用不同的實驗方法設(shè)計進(jìn)行提取。改變提取條件以確定提取因素變化范圍以及各因素的較佳值。每次提取液過濾，真空蒸發(fā)去除丙酮后，用去離子水定容至100ml，測定綠原酸的含量，并折算為每100g干葉中的提取得率?！　?.2.3 正交實驗設(shè)計在提取單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用正交實驗優(yōu)化工藝條件。以丙酮濃度、浸提溫度、浸提時間、料液比4個因素作為考察對象，每個因素選用3個水平。選用L9（34）表，并安排實驗，優(yōu)化工藝條件?！　?結(jié)果　　2.1丙酮濃度對提取率的影響　　在提取溫度35℃，料液比1∶12，提取時間2h，丙酮濃度對綠原酸提取率的影響見圖1。由圖1可以看出，當(dāng)濃度低于40%時，隨著丙酮濃度的增加，綠原酸的提取率升高，用40%丙酮的提取，其提取率最高。隨后，綠原酸的提取率隨丙酮的濃度的升高而降低?！　?.2溫度對提取率的影響　　不同提取溫度對綠原酸提取率的影響見圖2。從圖2可以看出，隨著提取溫度的升高，其提取率增加，當(dāng)溫度高于55℃時，不再增加。這是由于溫度升高，分子運動加快，有利于分子的擴散，有利于活性物質(zhì)的溶出；當(dāng)溫度過高時，丙酮氣化，不利于活性成分的析出，而且溫度過高，雜質(zhì)溶出量也相應(yīng)增大，活性成分易分解破壞?！　?.3料液比對提取率的影響　　不同料液比對綠原酸提取率的影響見圖3。隨著溶劑量的增加，浸提效果也隨之增高，但提高幅度減小。當(dāng)料液比超1∶12時，它們的提取率無明顯變化。料液比過大給后續(xù)蒸發(fā)工序造成困難，且成本增大，因此，料液比采用1∶12左右為宜?！　?.4提取時間對提取率的影響 　　在提取液中，當(dāng)植物材料細(xì)胞內(nèi)外活性成分含量未達(dá)到平衡時，提取率隨提取時間的延長而增加。一旦細(xì)胞內(nèi)外濃度達(dá)到平衡，活性成分不再溶出。提取時間對綠原酸提取率的影響見圖4。從圖4可以看出，隨著提取時間的增加，綠原酸的提取率不斷提高，尤其是從1h延長到2h時，綠原酸提取率提高幅度較大，提取時間在2h和3h之間綠原酸提取率基本保持穩(wěn)定趨勢。而提取時間在3h以后綠原酸提取得率呈現(xiàn)出緩慢上升趨勢?！　?.5提取次數(shù)對提取率的影響　　在其它條件不變的情況下，提取次數(shù)對綠原酸提取率的影響見圖5。從圖5可以看出，提取次數(shù)多，綠原酸的提取率高。當(dāng)提取次數(shù)超過兩次時，提取率增加不明顯。所以，提取次數(shù)以兩次為好?！　?.6pH值對提取效果的影響　　在固定料液比1∶12，提取溫度35℃，提取時間2h的情況下，用不同pH的40%丙酮提取，浸提劑pH對提取效果的影響見圖6。 從圖6可以看出，對于綠原酸的提取，當(dāng)pH值低于4時，隨著pH值的增加提取率增加；當(dāng)pH=4時，綠原酸的提取率達(dá)到最大；當(dāng)pH值再增加時，提取率下降。綠原酸是極性有機酸，在酸性介質(zhì)中比較穩(wěn)定，因此，綠原酸的提取，宜在酸性溶劑中進(jìn)行。但是，無論是堿性溶劑提取還是酸性溶劑提取，都會影響廢水的排放處理，從產(chǎn)業(yè)化和環(huán)境保護(hù)考慮，其均不宜在酸性或堿性溶劑中提取，宜在中性水溶液中進(jìn)行，因此，pH值對提取率的影響在以后的工藝條件優(yōu)化中不做考慮。　　2.7丙酮-水溶液提取綠原酸工藝條件的優(yōu)化從以上單因素可知，杜仲葉綠原酸在提取過程中，受到浸提時間、溫度、丙酮濃度和丙酮溶液用量等因素的影響。為探索最佳提取條件，在單因素的基礎(chǔ)上，對上述4個因素分別取3個水平，采用L9（34）正交實驗設(shè)計進(jìn)行優(yōu)化，各因素和水平如表1。正交實驗方案和結(jié)果見表2。各因素與綠原酸提取率的關(guān)系直觀圖見圖7。表1影響綠原酸提取率的因素及水平數(shù)（略）表2綠原酸提取正交實驗表L9（34）（略）對正交實驗有關(guān)數(shù)據(jù)作極差分析，結(jié)果見表2。由表2可知，各因素對綠原酸提取率的影響程度依次為C＞A＞B＞C。在4個影響因素中，料液比、溫度對提取率影響較大，其次是丙酮濃度，影響最小的是浸提時間。由圖7表明，以綠原酸提取率為考察指標(biāo)，依次最佳工藝條件是A3B2C2D3，各因素的最佳水平分別是：浸提溫度65℃，濃度40%，料液比1∶12，浸提時間3 h。說明綠原酸提取率明顯受到溫度的影響，因為升高溫度，增加分子的熱運動，使溶劑和葉粉分子間的傳遞加速，有利于綠原酸的浸出。但綠原酸為熱敏性物質(zhì)，溫度過高，會造成綠原酸的分解，并引起丙酮汽化揮發(fā)損失。因此溫度控制在65℃以下。丙酮的濃度對提取率的影響次之，隨著濃度增加，溶劑極性降低，同綠原酸的極性差拉大，不利于綠原酸的浸出。料液比的增大，溶劑與葉粉固體溶質(zhì)間的濃度差增大，有利于傳質(zhì)，因此，綠原酸提取率增大。料液比增大，雖然有利于傳質(zhì)，但料液回收量增加影響成本。因此，料液比應(yīng)控制在1∶12為最佳。浸提時間延長，有利于提取率的增加，但時間過長，綠原酸分解，反而降低綠原酸的含量，時間過短，也不利于綠原酸的浸提，應(yīng)控制在3h以內(nèi)為宜?！　≡谔崛∵^程中發(fā)現(xiàn)，丙酮-水體系作浸提劑，其提取液中蛋白質(zhì)、黏液含量減少，而糅質(zhì)含量增加，蛋白質(zhì)在丙酮中的溶解度較小，而丙酮-水體系為糅質(zhì)的最佳溶劑〔14〕；提取液始終呈褐色，葉綠素等色素析出較少。因此，采用丙酮-水體系避免了醇溶性色素的大量析出，有利于綠原酸的分離和純化。但缺點是丙酮溶液提取，其綠原酸提取率相對于水溶液提取和醇溶液提取低?！　?.8最佳條件下的放大驗證實驗取100g干燥粉碎的杜仲葉裝入2000ml燒瓶中，在最佳提取條件下浸提，重復(fù)實驗3次取平均值。結(jié)果見表3。表3 丙酮提取工藝驗證實驗結(jié)果（略）　　3結(jié)論采用丙酮為溶劑提取綠原酸，避免了醇溶色素的溶出，提取物純度高，但得率稍低。單因素實驗和正交實驗分析研究表明，提取杜仲葉綠原酸的最佳工藝條件：乙醇濃度40%，提取溫度65℃；料液比1∶12，提取時間3h，浸提兩次。通過在最佳條件下的驗證實驗表明，綠原酸的提取率為2.25%，提取物得率17.25%，綠原酸含量13.12%?！?/p>