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《結(jié)締組織生長因子在病理性瘢痕中的表達(dá)》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、結(jié)締組織生長因子在病理性瘢痕中的表達(dá)作者：陶常波，金培生，張愛君，李雪陽【摘要】目的探討結(jié)締組織生長因子（CTGF）在病理性瘢痕形成中的作用。方法采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（RT-PCR）檢測10例瘢痕疙瘩（瘢痕疙瘩組）和10例增生性瘢痕（增生性瘢痕組）中的CTGFmRNA的表達(dá)，并以8例正常皮膚（正常皮膚組）作為對照。結(jié)果病理性瘢痕中CTGFmRNA表達(dá)均明顯高于正常皮膚組（P<0.05），而瘢痕疙瘩組又高于增生瘢痕組（P<0.05）。結(jié)論CTGF在病理性瘢痕的形成過程中起到重要作用?！娟P(guān)鍵詞】瘢痕疙瘩；增生性瘢痕；結(jié)締組織生長因子Ab
2、stract:ObjectiveToexploretheeffectofconnectivetissuegroerasechainreaction(RT-PCR)RNAin10casesofkeloid(keloidgroup),10casesofhypertrophicscar(hypertrophicscar)and8casesofnormalskin(normalcontrolgroup).Resultsparedalcontrolgroup,CTGFmRNARNAayplayanimportantroleinthepathogenesisofpat
3、hologicalscar. Keyogehizer公司);Eppendorf-5840R臺式冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；PCR擴增儀PTC-100(美國MJResearch公司)；電腦三恒多用電泳儀（北京六一儀器廠）；凝膠成像系統(tǒng)INGENIUS(美國基因有限公司)?！ ?.4實驗方法 1.4.1引物準(zhǔn)備 參照人CTGFcDNA序列，進行特異性CTGF引物設(shè)計，同時選取β-actin作為內(nèi)參照。CTGF序列：上游5'-AACTATGATTAGAGCCAACTGCCTG-3'，下游5'-TCATGCCATGTCTCCGTACATCTTC
4、-3',擴增片段長度為475bp，β-actin：上游5'-CCGCGAGAAGATGACCCAGAT-3'，下游5'-GAAGCATTTGCGGTGGACGA-3'用這對引物可擴增β-actincDNA片段長度為781bp。引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成?！ ?.4.2組織總RNA提取 取標(biāo)本組織50mg，剪碎后加入1mlTRNzol試劑，電動組織勻漿器勻漿，其后操作步驟按照試劑說明書進行。抽提的總RNA測D260nm和D280nm，并計算比值為1.6～2.0，余下RNA加入30～100μl不含RNA酶的雙蒸水,－70℃冰箱保存?zhèn)溆??！ ?/p>
5、1.4.3逆轉(zhuǎn)錄（RT） 反應(yīng)總體積10μl，RNA模板1μl(2μg),RNA酶抑制劑0.5μl，5×RTBuffer2μl,10mmol/LdNTP1μl,隨機引物0.5μl，逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μl，不含RNA酶的雙蒸水4.5μl。按以下條件進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):室溫10min，45℃45min，95℃5min，4℃5min。cDNA－20℃保存或直接擴增?！ ?.4.4PCR擴增 按以下條件配制反應(yīng)液：10×PCRBuffer2.5μl,10mmol/LdNTP混合物0.5μl,5μmol/LCTGF上游及下游特異性引物各0.5μl,TapmixDNA聚合
6、酶0.5μl，RT產(chǎn)物2.5μl,加不含RNA酶的雙蒸水18μl至總體積25μl。按以下條件進行PCR反應(yīng)：94℃預(yù)變性3min,然后94℃30s,65℃30s,72℃7min,72℃5min,循環(huán)30次，末次延伸72℃5min?！ ?.4.5結(jié)果分析 取10μlPCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳（電壓8V/cm）,溴化乙啶（EB）染色，以β-actin為內(nèi)參照，設(shè)定值為1，經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)分析其灰度值并計算比值。 1.5統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，采用q檢驗進行兩兩比較，P＜
7、0.05為差異有顯著性。 2結(jié)果 2.1PCR產(chǎn)物結(jié)果 3組PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離并在紫外燈下觀察，可見到位于781bp和475bp處各有1條特異性條帶，與預(yù)期擴增片段長度相符。電泳結(jié)果見圖1。 2.2各組間CTGFmRNA表達(dá)量（相對于β-actin）的比較 瘢痕疙瘩組與增生性瘢痕組CTGFmRNA表達(dá)量均明顯高于正常皮膚組(P＜0.05），而瘢痕疙瘩組表達(dá)量又高于增生性瘢痕組（P＜0.05）。見表1。表13組間CTGFmRNA表達(dá)量的比較（略） 3討論CTGF是1991年Bradham等［3］用親和色譜法在人體臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中
8、發(fā)現(xiàn)的，是一種富含半胱氨酸的多肽。在其他種屬的動物如豬、牛、蛙等體
