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《gfp共表達的重構(gòu)型caspase》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、GFP共表達的重構(gòu)型Caspase作者：余曉林，劉紅，陳萬平，程鵬遠【關(guān)鍵詞】基因轉(zhuǎn)染EffectsofrebinantCaspase3onhumanlaryngocarcinomacelllineHep2throughcoexpressionacelllineHep2.METHODS:RebinantCaspase3geneanlaryngocarcinomacelllineHep2ine2000andtheexpressionofrebinantCaspase3orphologicalchangesicroscopeandthecellsurvivalra
2、teaftertransfectionethod.RESULTS:RebinantCaspase3geneacelllineHep2andeffectivelyinduceittoapoptosis. 【Keyine2000、新生牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；小量質(zhì)粒提取試劑盒、T4DNA連接酶均購自Promega公司；含具有自發(fā)活性的重構(gòu)型Caspase3基因的pcDNA3revCasp3真核表達載體由第四軍醫(yī)大學門診部保存，重構(gòu)型人Caspase3基因克隆于該載體的EcoRI和XbaI位點間；pEGFPC1載體購自Clontech公司，其上攜
3、帶有綠色熒光蛋白(GFP)報告基因. 1.2方法 取約3μgpcDNA3revCasp3及pEGFPC1載體分別經(jīng)EcoRI和XbaI雙酶切，各自回收并純化片段及載體后按照3∶1比例經(jīng)T4連接酶4℃連接過夜并轉(zhuǎn)化0.1mol/LCaCl2制備的E.coliDH5α感受態(tài)細菌，涂布于含卡那霉素(0.05g/L)的LB培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)過夜.隨機挑選陽性重組質(zhì)粒小量質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒并經(jīng)EcoRI和XbaI雙酶切進行鑒定，重組質(zhì)粒命名為pEGFPCaspase3. 1.2.1基因轉(zhuǎn)染細胞形態(tài)觀察轉(zhuǎn)染前24h將細胞分別鋪于6孔板，待細胞生長至約70％時，分
4、別取lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑8μL及3μgpEGFPCaspase3質(zhì)粒、pEGFPC1空載體分別稀釋于250μL無血清DMEM，5min內(nèi)將稀釋的質(zhì)粒脂質(zhì)體混合后室溫靜置20min后，將混合物逐滴加入到6孔板后置于37℃50mL/LCO2孵箱培養(yǎng).轉(zhuǎn)染后的1~6d取倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化. 1.2.2檢測重構(gòu)型人Caspase3基因的表達取轉(zhuǎn)染后48hHep2細胞約1×106個，用2.5g/L胰蛋白酶消化，1000r/min離心5min后棄去培養(yǎng)基，1倍PBS洗2次并收集細胞.以Trizol試劑盒提取轉(zhuǎn)染細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照反
5、轉(zhuǎn)錄試劑盒操作進行，取5μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進行PCR擴增，95℃30s，50℃30s，72℃2min，30個循環(huán)，取4μLPCR產(chǎn)物，在含0.5mg/L溴化乙錠(EB)的瓊脂糖凝膠(15g/L)中電泳分析，紫外觀測儀觀察結(jié)果. 1.2.3熒光顯微鏡觀察基因表達轉(zhuǎn)染后的1~6d分別于熒光顯微鏡下觀察表達載體上GFP報告基因的表達，間接監(jiān)測表達載體及目的基因的表達情況，同時對熒光顯微鏡下細胞形態(tài)變化進行觀察. 1.2.4轉(zhuǎn)染Caspase3基因后細胞凋亡的電鏡檢測Hep2細胞株轉(zhuǎn)染Caspase3基因后48h經(jīng)胰酶消化，PBS洗滌，離心去上清，沿管壁緩加入2
6、5g/L戊二醛，4℃固定2h，撥離細胞團塊，PBS洗滌2次，常規(guī)脫水，包埋，制備超薄切片，染色，水洗，晾干，電鏡觀察. 1.2.5MTT法測定轉(zhuǎn)染Caspase3對Hep2細胞的抑制作用將未轉(zhuǎn)染的Hep2細胞以2.5×107／L的密度接種于96孔板，每孔200μL,保留一排孔作為調(diào)零孔，待細胞貼壁后，分3組（轉(zhuǎn)染組、空載體組、不轉(zhuǎn)染組）進行轉(zhuǎn)染，每組不同時間點平行3孔(n=3).分別于轉(zhuǎn)染后的不同時間點（12，24，36，48，60，72h）吸棄培養(yǎng)液，加入200μL新配制的MTT(5g/L)，37℃繼續(xù)孵育4h,棄MTT液加入DMSO150μL，混勻，待所
7、有樣品作完上述處理后，用DG3022型酶標儀，測490nm波長吸光度，并作圖將實驗組與對照組進行比較. 統(tǒng)計學處理：所有數(shù)據(jù)采用x±s表示，采用SPSS12.0軟件處理，組間比較采用方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義. 2結(jié)果 2.1pEGFPCaspase3表達載體的酶切鑒定酶切產(chǎn)物在含0.5mg/L溴化乙錠(EB)的瓊脂糖凝膠(15g/L)中電泳分析，紫外觀測儀觀察結(jié)果(Fig1). 2.2重構(gòu)型人Caspase3基因的RTPCR檢測Caspase3基因在Hep2細胞中mRNA水平得到表達，而空載體組及空白組細胞沒有檢測到相應(yīng)大小的特
8、異性片段(Fig2). 2.3Cas
