pten基因重組腺病毒對卵巢癌細(xì)胞生長的抑制作用

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1、pten基因重組腺病毒對卵巢癌細(xì)胞生長的抑制作用作者：林觀平,熊亮,李樹梅,黃秀蘭,周克元【摘要】目的:觀察攜帶野生型pten基因的重組腺病毒(Adpten)體外轉(zhuǎn)染高轉(zhuǎn)移卵巢癌HO8910PM細(xì)胞后的表達(dá)，并研究其對卵巢癌細(xì)胞抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡和抑制遷移的作用.方法:利用AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建Adpten，體外轉(zhuǎn)染高轉(zhuǎn)移卵巢癌HO8910PM細(xì)胞，熒光顯微鏡檢測Adpten的轉(zhuǎn)染效率.細(xì)胞中的表達(dá)；MTT實驗觀察pten對細(xì)胞生長的影響；HE染色法觀察外源性pten基因表達(dá)對細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影

2、響；細(xì)胞劃痕實驗觀察pten對細(xì)胞遷移的抑制作用；Hoechest33258凋亡染色檢測pten基因?qū)O8910PM細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用.結(jié)果:外源性野生型pten基因經(jīng)腺病毒介導(dǎo)成功轉(zhuǎn)入HO8910PM細(xì)胞，OI為100時，體外轉(zhuǎn)染效率高達(dá)90%以上.pten顯著抑制HO8910PM細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡并能抑制其遷移.結(jié)論:重組腺病毒是高效的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，能將pten目的基因高效地轉(zhuǎn)移到高轉(zhuǎn)移卵巢癌HO8910PM細(xì)胞中，對細(xì)胞產(chǎn)生強有力的生長抑制及凋亡誘導(dǎo)作用，并能抑制其遷移.【關(guān)鍵詞】卵巢腫瘤；基

3、因治療；pten基因；腺病毒；細(xì)胞凋亡；遷移抑制0引言抑癌基因pten，即第10號染色體缺失的與張力蛋白同源的基因，是繼p53后又一個與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的抑癌基因，其編碼具有雙重特異磷酸酶活性的蛋白，可以反向調(diào)控磷脂酰肌醇(3)激酶（phosphatidylinositol3kinase，PI3K）/AKt信號傳導(dǎo)途徑，從而抑制細(xì)胞生長增殖.其突變和缺失多發(fā)于乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌等［1-3］.在某些pten基因突變或缺失的癌細(xì)胞中過表達(dá)PTEN蛋白能抑制細(xì)胞增殖和腫瘤的形成，使其細(xì)胞周期停滯在

4、G1期并發(fā)生細(xì)胞凋亡［4-5］，而且在某些沒有pten基因突變的癌細(xì)胞中,使pten基因過表達(dá)也能抑制這些癌細(xì)胞生長，誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡［6］；另外，pten基因還能抑制癌細(xì)胞的侵潤轉(zhuǎn)移，降低其遷移能力.這就提示pten基因用于癌癥基因治療有著重要意義.而基因治療載體的選擇最為重要，當(dāng)今運用最多最廣泛的就是腺病毒(adenovirus,Ad)載體，其具有在哺乳動物及其他多種生物細(xì)胞上進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移和蛋白表達(dá)的高效性和不整合宿主細(xì)胞的性質(zhì)，是一種比較安全，轉(zhuǎn)染效率又高的載體［7］.本研究采用攜帶野生型pten基因的重組

5、腺病毒(Adpten)，將pten基因?qū)肴烁咿D(zhuǎn)移卵巢癌HO8910PM細(xì)胞，觀察其在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)，研究其對卵巢癌細(xì)胞生長抑制、遷移抑制、誘導(dǎo)凋亡的作用，對卵巢癌的基因治療進(jìn)行初步的探索并提供有意義的參考數(shù)據(jù).1材料和方法1.1材料人高轉(zhuǎn)移卵巢癌HO8910PM細(xì)胞和人胚腎細(xì)胞293T購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所；野生型pten表達(dá)質(zhì)粒（erson公司產(chǎn)品.Hoechst33258細(xì)胞凋亡染色試劑盒購于武漢碧云天生物技術(shù)公司.1.2方法1.2.1重組腺病毒載體的構(gòu)建及細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用細(xì)菌內(nèi)同源重組

6、的方法，構(gòu)建攜帶野生型pten基因的重組腺病毒Adpten及陰性對照Adgfp［8］.HO8910PM細(xì)胞培養(yǎng)于含100mL/L小牛血清、100U/mL青霉素和100mg/L鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，置50mL/LCO2,37℃孵箱培養(yǎng).1.2.2Adpten轉(zhuǎn)染效率的測定取指數(shù)生長期的高轉(zhuǎn)移卵巢癌HO8910PM細(xì)胞，以5×104/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，24h后吸棄培養(yǎng)基，換無血清RPMI1640培養(yǎng)基，用25，50，100感染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection,MOI

7、=病毒顆粒數(shù)/轉(zhuǎn)染的細(xì)胞數(shù))的腺病毒感染,培養(yǎng)6h后，換完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng).24h后在熒光顯微鏡下計數(shù)gfp陽性細(xì)胞百分率.確定HO8910PM細(xì)胞轉(zhuǎn)染所需的MOI值，使得轉(zhuǎn)染效率＞90%.1.2.3OI=100加入病毒，設(shè)Adpten組和Adgfp組，培養(yǎng)6h后，換完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng).48h后提取細(xì)胞總蛋白；以Bradford酶標(biāo)儀蛋白定量法測定蛋白含量，然后作SDSPAGE（12g/L），于4℃冰箱中90mA恒流電轉(zhuǎn)過夜，使目的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,封閉液于4℃封閉過夜，將膜轉(zhuǎn)至新的封袋中，按0

8、.1mL/cm2加入適量的一抗稀釋液（小鼠抗人PTEN單抗按1∶300封閉液稀釋，山羊抗人Actin多抗按1∶500封閉液稀釋），封口后，室溫下平緩搖動反應(yīng)4h.TBS洗滌后加入二抗稀釋液（PTEN,Actin的二抗均按1∶2000封閉液稀釋），同條件反應(yīng)1h.大量TBS洗滌去除未結(jié)合的二抗.ECL（化學(xué)發(fā)光）處理，暗箱中以X光膠片曝光，顯影、定影.1.2.4MTT法測定HO8910