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《蛋白質(zhì)的定量測(cè)定方法》由會(huì)員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫(kù)。
1、實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)的定量測(cè)定方法【實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)】1.試比較Folin酚法與考馬斯亮藍(lán)染料結(jié)合比色法的優(yōu)缺點(diǎn)。2.試比較二喹啉甲酸法與Folin酚法的優(yōu)缺點(diǎn)。3.凱氏定氮法中在消化樣品時(shí),加入濃硫酸,硫酸鉀和硫酸銅粉末的目的是什麼?4.紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理是什麼?一、Folin酚試劑法(Lowry法)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.學(xué)習(xí)Folin酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理。2.掌握Folin酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法和操作?!緦?shí)驗(yàn)原理】蛋白質(zhì)中含有酪氨酸和色氨酸殘基,能與Folin酚試劑起氧化還原反應(yīng)。反應(yīng)過(guò)程分為兩步,第一步:在堿性溶液中,蛋白質(zhì)分子中的肽鍵與堿性銅試劑中的Cu
2、2+作用生成蛋白質(zhì)Cu2+復(fù)合物;第二步:蛋白質(zhì)Cu2+復(fù)合物中所含的酪氨酸或色氨酸殘基還原酚試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸,生成藍(lán)色的化合物。該呈色反應(yīng)在30分鐘內(nèi)即接近極限,并且在一定濃度范圍內(nèi),藍(lán)色的深淺度與蛋白質(zhì)濃度呈線性關(guān)系,故可用比色的方法確定蛋白質(zhì)的含量。進(jìn)行測(cè)定時(shí)要根據(jù)蛋白質(zhì)濃度的不同選用不同的測(cè)定波長(zhǎng):若蛋白質(zhì)含量高時(shí)(25100μg)在500nm波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定,含量低時(shí)(525μg)在755nm波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定。最后根據(jù)預(yù)先繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出未知樣品中蛋白質(zhì)的含量。Folin酚試劑法操作簡(jiǎn)便,靈敏度高,樣品中蛋白質(zhì)含量高于5μg即可測(cè)得,是測(cè)定蛋白質(zhì)含量
3、應(yīng)用得最廣泛的方法之一?!緦?shí)驗(yàn)用品】1.實(shí)驗(yàn)器材100毫升容量瓶2只;移液管1毫升4支,5毫升2支;分光光度計(jì)。2.實(shí)驗(yàn)試劑(1)Fo1in酚試劑甲:將lg碳酸鈉溶于50mL0.lmol/L氫氧化鈉溶液中,再把0.5g硫酸銅(CuSO4?5H2O)溶于100mL1%酒石酸鉀(或酒石酸鈉)溶液,然后將前者50mL與后者lmL混合?;旌虾?日內(nèi)使用有效。(2)Folin酚試劑乙:在1.5L容積的磨口回流瓶中加入100g鎢酸鈉(Na2WO4?2H2O)、25g鉬酸鈉(Na2MoO4?2H2O)、700mL蒸餾水、50mL85%磷酸及100mL濃鹽酸,充分混勻后回流10h
4、?;亓魍戤叄偌?50g硫酸鋰、50mL蒸餾水及數(shù)滴液體溴,開(kāi)口繼續(xù)沸騰15分鐘,以便驅(qū)除過(guò)量的溴,冷卻后定容到1000mL。過(guò)濾,如顯綠色,可加溴水?dāng)?shù)滴使氧化至溶液呈淡黃色。置于棕色瓶中暗處保存。使用前用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定,酚酞為指示劑,以標(biāo)定該試劑的酸度,一般為2mol/L左右(由于濾液為淺黃色,滴定時(shí)濾液需稀釋100倍,以免影響滴定終點(diǎn)的觀察)。使用時(shí)適當(dāng)稀釋(約1倍),使最后濃度為lmol/L酸。(3)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液:用分析天平精密稱取牛(或人)血清白蛋白100毫克,用少量蒸餾水完全溶解后,轉(zhuǎn)移至100毫升容量瓶中,準(zhǔn)確稀釋至刻度,使蛋白質(zhì)濃度1mg/m
5、L。(4)樣品溶液:配制約0.5mg/mL的酪蛋白溶液作為未知樣品溶液。【方法步驟】1.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線取7支試管,按下表分別加入各試劑各管加入Fo1in酚試劑乙后,立即搖勻,放置30分鐘后比色,在500nm處記下各管光密度,以0號(hào)管為對(duì)照,以光密度為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.測(cè)定未知樣品:取2支試管,分別準(zhǔn)確吸取1毫升樣品溶液,各加5毫升Fo1in酚試劑甲,搖勻,室溫放置10分鐘后,再各加1毫升Fo1in酚試劑乙,立即搖勻,放置30分鐘,在500nm處測(cè)定光密度值?!緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】根據(jù)未知樣品溶液的光密度值,在繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖中查出樣品溶液
6、中的蛋白質(zhì)含量?!咀⒁馐马?xiàng)】注意要準(zhǔn)確配制所用試劑,準(zhǔn)確量取各溶液?!緦?shí)驗(yàn)報(bào)告】總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,并分析評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。二、紫外吸收法【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.學(xué)習(xí)紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理。2.掌握紫外分光光度計(jì)的操作方法?!緦?shí)驗(yàn)原理】大多數(shù)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中含有芳香族氨基酸(酪氨酸和色氨酸)殘基,使蛋白質(zhì)在280nm的紫外光區(qū)產(chǎn)生最大吸收,并且這一波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收值與蛋白質(zhì)濃度的成正比,利用這一特性可定量測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。紫外吸收法可測(cè)定0.1-0.5mg/ml的蛋白質(zhì)溶液,此操作簡(jiǎn)便,測(cè)定迅速,不消耗樣品,低濃度鹽類(lèi)不干擾測(cè)定。因此,此法在蛋白質(zhì)的制備中廣泛應(yīng)用。【實(shí)驗(yàn)用
7、品】1.實(shí)驗(yàn)器材試管及試管架;50毫升容量瓶2只;移液管;紫外分光光度計(jì)。2.實(shí)驗(yàn)試劑(1)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液:精確配制2mg/mL的酪蛋白溶液。(2)樣品溶液:配制約0.5mg/mL的酪蛋白溶液作為未知樣品溶液?!痉椒ú襟E】1.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線取7支試管按下列各表加入各試劑:試劑加完后搖勻,在紫外分光光度計(jì)上,于280nm處以0號(hào)管為對(duì)照,分別測(cè)定各管溶液的光密度值。以光密度為縱座標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液濃度為橫座標(biāo),繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.測(cè)定未知樣品取樣品溶液4毫升,加蒸餾水4mL混勻,在280nm下測(cè)定其光密度值?!緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】根據(jù)樣品溶液的光密度值,在繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖中查出
8、樣品溶液的