蛋白質(zhì)的定量測(cè)定方法

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1、實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)的定量測(cè)定方法【實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)】1.試比較Folin酚法與考馬斯亮藍(lán)染料結(jié)合比色法的優(yōu)缺點(diǎn)。2.試比較二喹啉甲酸法與Folin酚法的優(yōu)缺點(diǎn)。3.凱氏定氮法中在消化樣品時(shí)，加入濃硫酸，硫酸鉀和硫酸銅粉末的目的是什麼？4.紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理是什麼？一、Folin酚試劑法(Lowry法)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.學(xué)習(xí)Folin酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理。2.掌握Folin酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法和操作?！緦?shí)驗(yàn)原理】蛋白質(zhì)中含有酪氨酸和色氨酸殘基，能與Folin酚試劑起氧化還原反應(yīng)。反應(yīng)過(guò)程分為兩步，第一步：在堿性溶液中，蛋白質(zhì)分子中的肽鍵與堿性銅試劑中的Cu

2、2+作用生成蛋白質(zhì)Cu2+復(fù)合物；第二步：蛋白質(zhì)Cu2+復(fù)合物中所含的酪氨酸或色氨酸殘基還原酚試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸，生成藍(lán)色的化合物。該呈色反應(yīng)在30分鐘內(nèi)即接近極限，并且在一定濃度范圍內(nèi)，藍(lán)色的深淺度與蛋白質(zhì)濃度呈線性關(guān)系，故可用比色的方法確定蛋白質(zhì)的含量。進(jìn)行測(cè)定時(shí)要根據(jù)蛋白質(zhì)濃度的不同選用不同的測(cè)定波長(zhǎng)：若蛋白質(zhì)含量高時(shí)（25100μg）在500nm波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定，含量低時(shí)(525μg)在755nm波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定。最后根據(jù)預(yù)先繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出未知樣品中蛋白質(zhì)的含量。Folin酚試劑法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，樣品中蛋白質(zhì)含量高于5μg即可測(cè)得，是測(cè)定蛋白質(zhì)含量

3、應(yīng)用得最廣泛的方法之一?！緦?shí)驗(yàn)用品】1.實(shí)驗(yàn)器材100毫升容量瓶2只；移液管1毫升4支，5毫升2支；分光光度計(jì)。2.實(shí)驗(yàn)試劑(1)Fo1in酚試劑甲：將lg碳酸鈉溶于50mL0.lmol／L氫氧化鈉溶液中，再把0.5g硫酸銅(CuSO4?5H2O)溶于100mL1％酒石酸鉀(或酒石酸鈉)溶液，然后將前者50mL與后者lmL混合?；旌虾?日內(nèi)使用有效。(2)Folin酚試劑乙：在1.5L容積的磨口回流瓶中加入100g鎢酸鈉(Na2WO4?2H2O)、25g鉬酸鈉(Na2MoO4?2H2O)、700mL蒸餾水、50mL85％磷酸及100mL濃鹽酸，充分混勻后回流10h

4、?；亓魍戤叄偌?50g硫酸鋰、50mL蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開(kāi)口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅(qū)除過(guò)量的溴，冷卻后定容到1000mL。過(guò)濾，如顯綠色，可加溴水?dāng)?shù)滴使氧化至溶液呈淡黃色。置于棕色瓶中暗處保存。使用前用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定，酚酞為指示劑，以標(biāo)定該試劑的酸度，一般為2mol／L左右(由于濾液為淺黃色，滴定時(shí)濾液需稀釋100倍，以免影響滴定終點(diǎn)的觀察)。使用時(shí)適當(dāng)稀釋(約1倍)，使最后濃度為lmol／L酸。(3)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用分析天平精密稱取牛(或人)血清白蛋白100毫克，用少量蒸餾水完全溶解后，轉(zhuǎn)移至100毫升容量瓶中，準(zhǔn)確稀釋至刻度，使蛋白質(zhì)濃度1mg/m

5、L。(4)樣品溶液：配制約0.5mg/mL的酪蛋白溶液作為未知樣品溶液。【方法步驟】1.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線取7支試管，按下表分別加入各試劑各管加入Fo1in酚試劑乙后，立即搖勻，放置30分鐘后比色，在500nm處記下各管光密度，以0號(hào)管為對(duì)照，以光密度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.測(cè)定未知樣品：取2支試管，分別準(zhǔn)確吸取1毫升樣品溶液，各加5毫升Fo1in酚試劑甲，搖勻，室溫放置10分鐘后，再各加1毫升Fo1in酚試劑乙，立即搖勻，放置30分鐘，在500nm處測(cè)定光密度值?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】根據(jù)未知樣品溶液的光密度值，在繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖中查出樣品溶液

6、中的蛋白質(zhì)含量?！咀⒁馐马?xiàng)】注意要準(zhǔn)確配制所用試劑，準(zhǔn)確量取各溶液?！緦?shí)驗(yàn)報(bào)告】總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并分析評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。二、紫外吸收法【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.學(xué)習(xí)紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理。2.掌握紫外分光光度計(jì)的操作方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】大多數(shù)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中含有芳香族氨基酸（酪氨酸和色氨酸）殘基，使蛋白質(zhì)在280nm的紫外光區(qū)產(chǎn)生最大吸收，并且這一波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收值與蛋白質(zhì)濃度的成正比，利用這一特性可定量測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。紫外吸收法可測(cè)定0.1-0.5mg/ml的蛋白質(zhì)溶液，此操作簡(jiǎn)便，測(cè)定迅速，不消耗樣品，低濃度鹽類(lèi)不干擾測(cè)定。因此，此法在蛋白質(zhì)的制備中廣泛應(yīng)用。【實(shí)驗(yàn)用

7、品】1.實(shí)驗(yàn)器材試管及試管架；50毫升容量瓶2只；移液管；紫外分光光度計(jì)。2.實(shí)驗(yàn)試劑(1)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：精確配制2mg／mL的酪蛋白溶液。(2)樣品溶液：配制約0.5mg/mL的酪蛋白溶液作為未知樣品溶液?！痉椒ú襟E】1.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線取7支試管按下列各表加入各試劑：試劑加完后搖勻，在紫外分光光度計(jì)上，于280nm處以0號(hào)管為對(duì)照，分別測(cè)定各管溶液的光密度值。以光密度為縱座標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液濃度為橫座標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.測(cè)定未知樣品取樣品溶液4毫升,加蒸餾水4mL混勻，在280nm下測(cè)定其光密度值?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】根據(jù)樣品溶液的光密度值，在繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖中查出

8、樣品溶液的