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《棒曲霉菌中抗真菌肽的分離與純化》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫(kù)。
1、棒曲霉菌中抗真菌肽的分離與純化【關(guān)鍵詞】,棒曲霉菌;分離;真菌蛋白類［摘要］［目的］從棒曲霉菌培養(yǎng)上清液中分離純化具有抗真菌活性的肽類物質(zhì)（AFP）.［方法］用離子交換柱層析法分離AFP，利用反相高效液相色譜法進(jìn)一步純化，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分析確定相對(duì)分子質(zhì)量.［結(jié)果］從棒曲霉菌培養(yǎng)上清液中分離出1種具有抗真菌活性的AFP，純化后得到高活性的精制AFP，相對(duì)分子質(zhì)量約為8ku，MTT法測(cè)定結(jié)果表明AFP對(duì)5種真菌均具有明顯的抗真菌作用.［結(jié)論］棒曲霉菌培養(yǎng)上清液中含具有抗真菌活性的AFP.?。坳P(guān)鍵詞］棒曲霉菌;分離;真菌蛋白類ABSTRACT:OBJECTIVETopurifythep
2、eptideAspergillusclavalusdesmculturefluid.METHODSThepeptidenchromatographyandfurtherpurifiedbyreversephaseHPLC，andthemolecularinedbytricinegelelectrophoresis.RESULTSAkindofpeptideolecularethodshoculturefluid.Key;dissection;fungalproteins真菌在自然界分布廣泛，其中有些真菌可使人致病，而在有些真菌中則可提取抗生素或防腐劑等.本文從棒曲霉菌（Aspergill
3、usclavalusdesm）培養(yǎng)上清液中分離得到具有抗真菌作用的肽類物質(zhì)真菌抑制肽（antifungalpeptide，AFP），旨在為抗菌藥物及防腐劑的開發(fā)提供依據(jù). 1材料與方法1.1材料棒曲霉菌菌種由韓國(guó)科學(xué)技術(shù)研究院生命工學(xué)研究所提供;CM-Sepharose離子交換樹脂為瑞典Pharmacia公司產(chǎn)品;YPD，YM培養(yǎng)基及MTT試劑為美國(guó)DIFCO公司產(chǎn)品.超濾濃縮系統(tǒng)為Millipore公司產(chǎn)品;700型高效液相色譜儀和500型酶標(biāo)儀為美國(guó)BIORAD公司產(chǎn)品;全自動(dòng)層析儀為北京應(yīng)用新技術(shù)研究所產(chǎn)品. 1.2方法1.2.1粗提液的制備將棒曲霉菌置于YPD培養(yǎng)液中，振動(dòng)培養(yǎng)（
4、30℃）72h，取上清液用超濾方法（膜截留分子質(zhì)量為30ku）除去大分子蛋白，取濾過液，4℃保存，待進(jìn)一步純化.1.2.2CM-Sepharose離子交換柱層析用0.1mol/LTris-HCl（pH值為7.0）緩沖液，將CM-Sepharose柱（30cm×26cm）洗柱平衡，待穩(wěn)定后將粗提液上柱，速度為80mL/h，完畢后用0.1mol/LTris-HCl（pH值為7.0）緩沖液洗柱，然后用含1.0mol/L氯化鈉的0.1mol/LTris-HCl（pH值為7.0）緩沖液進(jìn)行洗脫，利用紫外分光光度儀于波長(zhǎng)280nm處進(jìn)行檢測(cè)，記錄洗脫曲線，收集出現(xiàn)峰值的洗脫液.1.2.3反相高效液相
5、色譜法（RP-HPLC）色譜柱為C18反相柱;流動(dòng)相:A液為0.5g/L三氟乙酸，B液為800mL/L乙腈加0.5g/L三氟乙酸，流動(dòng)速度為1.8mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm.將離子交換層析后收集的洗脫液經(jīng)除鹽濃縮后上柱，每次進(jìn)樣量為10μL，梯度洗脫，分別收集洗脫峰，冷凍干燥，凍干品即為AFP樣品［1］.1.2.4聚丙烯酰胺凝膠電泳主要組成為160g/L聚丙烯酰胺（含5g/LN，N-亞甲基雙丙烯酰胺），110g/L甘油，1g/LSDS.電極負(fù)極緩沖液為0.1mol/LTris-甘氨酸（pH值為8.2，含1g/LSDS）緩沖液，正極為0.2mol/LTris緩沖液（pH值為8.9）
6、.25mA電泳6h，行弱酸性艷藍(lán)G染色.1.2.5抗真菌活性測(cè)定采用MTT法進(jìn)行［2］，即取煙曲霉菌、黑曲霉菌、白色念珠菌及茄病鐮刀菌4種菌，分別用YM培養(yǎng)液加至96孔平底培養(yǎng)板上，每孔0.1mL，菌數(shù)為2×108個(gè)/L，待穩(wěn)定后向每孔加入倍比稀釋的AFP樣品，作用24h（30℃），每孔加入10μLMTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，每孔加入200g/LSDS溶液20μL，作用2h，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)405nm處檢測(cè)吸收值. 2結(jié)果粗提后的AFP樣品經(jīng)CM-Sepharose柱層析后，收集1個(gè)大洗脫峰（圖1）.RP-HPLC梯度洗脫得3個(gè)洗脫峰，其中峰1的峰值最高且對(duì)稱，單獨(dú)提取峰1并測(cè)定抗真菌活性，
7、證實(shí)為高度純化的AFP（圖2）.聚丙烯酰胺凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)，在相對(duì)分子質(zhì)量約為8ku處AFP樣品有一明顯的蛋白帶（圖3）.抗真菌活性測(cè)定結(jié)果示從棒曲霉菌中分離純化的AFP對(duì)4種真菌均具有抗真菌效應(yīng)，其中對(duì)曲霉菌屬和念珠菌的抗真菌效應(yīng)優(yōu)于對(duì)鐮刀菌，見表1.圖1CM-Sepharose離子交換柱層析洗脫圖（略）圖2反相高效液相色譜法洗脫峰（略） 3討論本文應(yīng)用離子交換層析法，首次從棒曲霉菌培養(yǎng)上清液中分離出具有抗真菌活性的多肽AFP，并
