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《大鼠海馬神經(jīng)元中μ阿片受體、cck受體的表達(dá)及慢性嗎啡作用對(duì)其表達(dá)的影響》由會(huì)員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫(kù)。
1、大鼠海馬神經(jīng)元中μ阿片受體、CCK受體的表達(dá)及慢性嗎啡作用對(duì)其表達(dá)的影響【摘要】目的:研究MOR1,CCKAR,CCKBR在海馬神經(jīng)元的分布和嗎啡對(duì)其受體的影響.方法:用激光共聚焦掃描技術(shù),以神經(jīng)元特異性標(biāo)記抗體NF200對(duì)原代海馬神經(jīng)元進(jìn)行鑒定,采用特異性的MOR1,CCKAR,CCKBR的抗體觀察觀察它們?cè)诤qR神經(jīng)元上的表達(dá).選用雄性O(shè)R1,CCKAR及CCKBR;給予嗎啡后2~4d,MOR1在海馬神經(jīng)元上的表達(dá)較對(duì)照增高(P<0.05),5d時(shí),MOR1的表達(dá)顯
2、著下降(P<0.01);隨嗎啡作用時(shí)間延長(zhǎng),CCKAR和CCKBR在海馬神經(jīng)元的表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì),且CCKBR的表達(dá)高于CCKAR(P<0.01).結(jié)論:海馬神經(jīng)元上同時(shí)存在MOR1,CCKAR和CCKBR,嗎啡作用時(shí)間越長(zhǎng),MOR1表達(dá)越弱,而CCKAR和CCKBR表達(dá)越強(qiáng).【關(guān)鍵詞】阿片受體;CCKA受體;CCKB受體;嗎啡依賴(lài);原代海馬神經(jīng)元;激光共聚焦;流式細(xì)胞術(shù) 0引言 研究表明μ受體(MOR1)是嗎啡等阿片類(lèi)物質(zhì)的主要作用位點(diǎn),鎮(zhèn)痛活性最強(qiáng),成癮
3、性也最強(qiáng)[1-2].另有實(shí)驗(yàn)研究表明:在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布著一種典型的腦腸肽-膽囊收縮素(cholecystokininoctapeptide,CCK),它是腦內(nèi)含量最高的一種神經(jīng)肽[3],其通過(guò)CCK受體發(fā)揮生理作用.實(shí)驗(yàn)已證實(shí):CCK受體拮抗劑不但能針對(duì)戒斷癥狀進(jìn)行對(duì)癥治療,而且有一定程度的防止復(fù)吸作用[4],但具體機(jī)制尚未完全闡明.本研究采用不同的實(shí)驗(yàn)技術(shù),重點(diǎn)闡明MOR1,CCKAR及CCKBR是否存在于海馬神經(jīng)元上以及嗎啡在不同的時(shí)間點(diǎn)對(duì)3種受體的影響,為進(jìn)一步研究CCK受體拮
4、抗劑對(duì)嗎啡依賴(lài)大鼠戒斷癥狀的影響及其機(jī)制的研究奠定必要的基礎(chǔ). 1材料和方法 1.1材料 健康雄性O(shè)R),沈陽(yáng)第一制藥廠生產(chǎn),批號(hào):遼寧藥準(zhǔn)字(1996)第002747號(hào).DMEM培養(yǎng)基、NeurobasalMedium,B27(美國(guó)Gibco公司);山羊抗CCKA,山羊抗CCKB抗體,兔抗MOR1多克隆抗體,F(xiàn)ITCdonkeyantimouseIgG,BiotindonkeyantirabbitIgG(美國(guó)SantaCruz公司);TRITCrabbitantigoa
5、tIgG,F(xiàn)ITCrabbitantigoatIgG,F(xiàn)ITCgoatantirabbitIgG(北京中山生物公司);CY5antirabbitIgG(Camical公司);小鼠抗NF200單克隆抗體(NEOMARKERS公司);兔抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)LEica);EpicsXL流式細(xì)胞儀(美國(guó)BeckmanCoulter). 1.2方法 1.2.1原代大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng) 取出生1d的大鼠在無(wú)菌條件下
6、分離海馬組織,制備細(xì)胞懸液,用含B27Supplement的NBM進(jìn)行原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng). 1.2.2神經(jīng)元鑒定 取培養(yǎng)6d的大鼠海馬神經(jīng)元,用免疫熒光標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行鑒定,一抗分別為GFAP多克隆抗體和NF200單隆抗體,二抗分別為BiotindonkeyantirabbitIgG+CY5antidonkeyIgG和FITCdonkeyantimouseIgG,標(biāo)記后選擇不同視野細(xì)胞進(jìn)行激光共聚焦掃描40x(激發(fā)波長(zhǎng)488nm,發(fā)射波長(zhǎng)530nm). 1.2.3MOR1,CC
7、KAR,CCKBR在海馬神經(jīng)元的表達(dá) 將原代海馬神經(jīng)元隨機(jī)分為NF200/MOR1,NF200/CCKAR,NF200/CCKBR3組,特異性抗體同上,用免疫熒光標(biāo)記和激光共聚焦掃描技術(shù)檢測(cè)受體的表達(dá). 1.2.4MOR1,CCKAR,CCKBR在嗎啡處理大鼠海馬神經(jīng)元的表達(dá) 1.2.4.1給藥與分組 60只健康雄性1~M9組(分別給予MOR1~9d),大鼠參照 2.2MOR1,CCKAR及CCKBR在海馬神經(jīng)元的表達(dá) 在海馬神經(jīng)元膜,軸突和樹(shù)突上均有發(fā)藍(lán)色熒光的
8、MOR1陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物(圖2A,D);綠色熒光標(biāo)記物與紅色熒光標(biāo)記物重疊之后呈橙黃色熒光,CCKA,CCKB受體呈橙黃色標(biāo)記,在海馬神經(jīng)元膜表面廣泛分布(圖2B,C,E,F(xiàn)). 2.3嗎啡對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元MOR1,CCKAR,CCKBR表達(dá)的影響 采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)給予嗎啡后MOR1,CCKAR,CCKBR在海馬神經(jīng)元上的表達(dá).給予嗎啡2d時(shí)MOR1上調(diào)(P<0.05),5d時(shí)MOR1開(kāi)始出現(xiàn)下調(diào),蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.01),并呈時(shí)間依