大鼠海馬神經(jīng)元中μ阿片受體、cck受體的表達及慢性嗎啡作用對其表達的影響

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1、大鼠海馬神經(jīng)元中μ阿片受體、CCK受體的表達及慢性嗎啡作用對其表達的影響【摘要】目的:研究MOR1，CCKAR，CCKBR在海馬神經(jīng)元的分布和嗎啡對其受體的影響.方法：用激光共聚焦掃描技術，以神經(jīng)元特異性標記抗體NF200對原代海馬神經(jīng)元進行鑒定，采用特異性的MOR1，CCKAR，CCKBR的抗體觀察觀察它們在海馬神經(jīng)元上的表達.選用雄性OR1，CCKAR及CCKBR；給予嗎啡后2~4d，MOR1在海馬神經(jīng)元上的表達較對照增高(P<0.05)，5d時，MOR1的表達顯

2、著下降(P<0.01)；隨嗎啡作用時間延長，CCKAR和CCKBR在海馬神經(jīng)元的表達呈上調(diào)趨勢，且CCKBR的表達高于CCKAR(P<0.01).結論：海馬神經(jīng)元上同時存在MOR1，CCKAR和CCKBR，嗎啡作用時間越長，MOR1表達越弱，而CCKAR和CCKBR表達越強.【關鍵詞】阿片受體；CCKA受體；CCKB受體；嗎啡依賴；原代海馬神經(jīng)元；激光共聚焦；流式細胞術　　0引言　　研究表明μ受體（MOR1）是嗎啡等阿片類物質(zhì)的主要作用位點，鎮(zhèn)痛活性最強，成癮

3、性也最強［1-2］.另有實驗研究表明：在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布著一種典型的腦腸肽－膽囊收縮素(cholecystokininoctapeptide,CCK)，它是腦內(nèi)含量最高的一種神經(jīng)肽［3］，其通過CCK受體發(fā)揮生理作用.實驗已證實：CCK受體拮抗劑不但能針對戒斷癥狀進行對癥治療，而且有一定程度的防止復吸作用［4］，但具體機制尚未完全闡明.本研究采用不同的實驗技術，重點闡明MOR1,CCKAR及CCKBR是否存在于海馬神經(jīng)元上以及嗎啡在不同的時間點對3種受體的影響，為進一步研究CCK受體拮

4、抗劑對嗎啡依賴大鼠戒斷癥狀的影響及其機制的研究奠定必要的基礎.　　1材料和方法　　1.1材料　　健康雄性OR)，沈陽第一制藥廠生產(chǎn)，批號：遼寧藥準字(1996)第002747號.DMEM培養(yǎng)基、NeurobasalMedium，B27(美國Gibco公司)；山羊抗CCKA，山羊抗CCKB抗體，兔抗MOR1多克隆抗體，F(xiàn)ITCdonkeyantimouseIgG，BiotindonkeyantirabbitIgG(美國SantaCruz公司)；TRITCrabbitantigoa

5、tIgG，F(xiàn)ITCrabbitantigoatIgG，F(xiàn)ITCgoatantirabbitIgG(北京中山生物公司)；CY5antirabbitIgG(Camical公司)；小鼠抗NF200單克隆抗體(NEOMARKERS公司)；兔抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)；激光共聚焦顯微鏡(德國LEica)；EpicsXL流式細胞儀(美國BeckmanCoulter).　　1.2方法　　1.2.1原代大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)　　取出生1d的大鼠在無菌條件下

6、分離海馬組織，制備細胞懸液，用含B27Supplement的NBM進行原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng).　　1.2.2神經(jīng)元鑒定　　取培養(yǎng)6d的大鼠海馬神經(jīng)元，用免疫熒光標記技術進行鑒定，一抗分別為GFAP多克隆抗體和NF200單隆抗體，二抗分別為BiotindonkeyantirabbitIgG＋CY5antidonkeyIgG和FITCdonkeyantimouseIgG，標記后選擇不同視野細胞進行激光共聚焦掃描40ｘ（激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長530nm）.　　1.2.3MOR1，CC

7、KAR，CCKBR在海馬神經(jīng)元的表達　　將原代海馬神經(jīng)元隨機分為NF200/MOR1，NF200/CCKAR，NF200/CCKBR3組，特異性抗體同上，用免疫熒光標記和激光共聚焦掃描技術檢測受體的表達.　　1.2.4MOR1，CCKAR，CCKBR在嗎啡處理大鼠海馬神經(jīng)元的表達　　1.2.4.1給藥與分組　　60只健康雄性1～M9組（分別給予MOR1~9d），大鼠參照　　2.2MOR1,CCKAR及CCKBR在海馬神經(jīng)元的表達　　在海馬神經(jīng)元膜，軸突和樹突上均有發(fā)藍色熒光的

8、MOR1陽性表達產(chǎn)物（圖2A，D）；綠色熒光標記物與紅色熒光標記物重疊之后呈橙黃色熒光，CCKA,CCKB受體呈橙黃色標記,在海馬神經(jīng)元膜表面廣泛分布（圖2B，C，E，F(xiàn)）.　　2.3嗎啡對大鼠海馬神經(jīng)元MOR1,CCKAR,CCKBR表達的影響　　采用流式細胞技術檢測給予嗎啡后MOR1，CCKAR，CCKBR在海馬神經(jīng)元上的表達.給予嗎啡2d時MOR1上調(diào)(P<0.05)，5d時MOR1開始出現(xiàn)下調(diào)，蛋白表達量顯著下降(P<0.01)，并呈時間依