轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因、β

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1、轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因、β1前言1.1玉米紋枯病研究進展1.1.1玉米紋枯病病原菌玉米紋枯病是由絲核菌(Rhizoctonia)引起的土傳病害，已報道的病原菌有三種：立枯絲核菌(R.soicmi)、未谷絲核菌(R.cerealis)、玉蜀黍絲核菌(高衛(wèi)東，1987;Ogoshi,1987)。這三種土壤習(xí)居絲核菌屬寄主十分廣泛，自然發(fā)病的寄主有15科近200種植物，常以菌絲的形式在水稻、玉米、高粱、大豆等農(nóng)作物上存活（侯明生和黃俊斌，2006)。紋枯病病菌不產(chǎn)生無性孢子，只產(chǎn)生菌絲體和菌核；其生長溫度7-39°C，適溫26-30°C；在PD

2、A上生長時菌絲開始為無色、較細、分隔距離較長，后期菌絲變粗變短，顏色變?yōu)樽刈仙梁稚痪z分支呈直角、近直角或銳角，分支處溢縮有橫膈膜；在PDA上培養(yǎng)2-3d后，在培養(yǎng)皿的周圍產(chǎn)生菌核，菌核形成溫度11-37°C，適溫22°C，開始菌核呈白色，后變成黑褐色不規(guī)則形，較緊密，表面粗糖（侯明生和黃俊斌，2006)。玉米紋枯病主要侵害玉米葉鞘基部，其次是果穗和荀葉，病情嚴重時，能侵入玉米的蓮桿（張培坤，2001)。玉米紋枯病的癥狀在葉鞘和葉片上表現(xiàn)為：形成暗綠色水漬狀的橢圓形或不規(guī)則形紋狀斑塊，斑塊邊緣有褐色暈紋，隨著病情的發(fā)展，病斑擴

3、大匯合成云紋狀或不規(guī)則形狀大病斑，包圍整個葉鞘，最后葉鞘腐敗繼而葉子枯黃；病斑向上擴展危害果穗時，荀葉也可見褐色云紋狀病斑，玉米籽粒灌裝不足，批粒增多，粒重下降，玉米好粒，穗軸容易變褐腐爛，影響玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)；危害蓮桿時，形成不規(guī)則褐色病斑，后期蓮桿質(zhì)地松軟，組織開始解體，纖維素暴露，玉米容易倒伏（唐海濤等，2004)。當(dāng)空氣干燥時，病斑中間呈灰白色，邊緣暗褐色；當(dāng)高溫多雨時，病斑會長出稠密的白色菌絲體，菌絲體集結(jié)形成黑褐色大小不一不規(guī)則顆粒狀的菌核，菌核在29-33°C時最易形成，菌核容易脫離寄主，遺落田間（宋佐衡等，1993;張培坤

4、等，2001)。1.2玉米遺傳轉(zhuǎn)化方法根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是植物基因工程眾多遺傳轉(zhuǎn)化方法中研究得最清楚、應(yīng)用最成功的一種，在已獲得的200多種轉(zhuǎn)基因植物中約80%是由該方法完成(王關(guān)林和方宏綺，1998)。有關(guān)農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米遺傳轉(zhuǎn)化的報導(dǎo)始于1987年，Grimsley等（1987)以幼苗分生組織為外植體，將玉米條紋病毒（MaizeStreakVims)的cDNA成功導(dǎo)入其中，部分葉片出現(xiàn)了病毒感染的癥狀。Shen和Hohn(1994)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將報告基因?qū)胗衩鬃越幌抵?，在胚芽鞘和幼葉中檢測到基因的表達。Gould等（1991)用農(nóng)桿

5、菌法轉(zhuǎn)化玉米蓮尖，獲得了轉(zhuǎn)基因玉米，并且首次證明外源基因已整合到玉米基因組巾并遺傳到Ti代。Ishida等（1996)將超雙元載體pSB131、pTOK233轉(zhuǎn)化A188及其雜交種的幼胚，轉(zhuǎn)化效率達到5%?30%，其后學(xué)者用超雙元載體分別轉(zhuǎn)化A188和Hill也得到了類似的結(jié)果（Negrottoetal.,2000;Zhaoetal.，1998;Zhaoetal.，1999;Zhaoetal.，1999)。Frame等（2002)將載體pTF102轉(zhuǎn)化Hill的幼胚，平均轉(zhuǎn)化效率達到了5.5%，To、Ti、T2代植株分子檢測表明基因和基因都整合到

6、玉米基因組中并穩(wěn)定表達。Sidorov等（2006)釆用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化I型愈傷組織，效率達到2%-10%BIA3301(質(zhì)粒圖譜見圖1)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)黃玉碧老師惠贈，質(zhì)粒pUbi-bar(圖譜見圖2)由華巾農(nóng)業(yè)大學(xué)孫東發(fā)老師惠贈.限制性內(nèi)切酶、保真酶、去憐酸化酶、dNTP、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PMD19-T載體購自Takala公司，PCR純化回收試劑盒、切膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，組培所用的MS培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基等購自PhytoTechnologyLaboratories公司，L-Cysteine、L-Proline

7、、MES等購自Sigma公司。2.1.4實驗所用的引物及其作用.LB培養(yǎng)基（液體)：NaCl10g、蛋白膝10g、酵母浸粉5g，用2mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，12rC滅菌20min,冷卻至50°C左右時加入相應(yīng)的抗生素。LB培養(yǎng)基（固體):NaCl10g、蛋白腺10g、酵母浸粉5g、瓊脂15g，用2mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0,121°C滅菌20min，使用前加入相應(yīng)的抗生素。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基、愈傷組織繼代培養(yǎng)基（/L):N6鹽4g、N6維生素ImL、1mg/mL2,4-D2mL、脯氨酸2.8g、庶糖30g、

8、水解酪蛋白100mg、肌醇lOOmg、植物凝膠4g,用1mol/L的KOH調(diào)節(jié)pH至5.8，121°C滅菌18min,冷卻至5(