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1、重樓皂苷對SGC【摘要】 目的研究重樓皂苷對SGC-7901人低分化胃腺癌細胞的作用及影響機制。方法在體外應用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法觀察重樓皂苷對細胞生長的抑制作用；應用Fluo-3／AM熒光標記技術和激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)檢測不同藥物濃度處理的SGC-7901人低分化胃腺癌細胞〔Ca2+〕i的變化。結果重樓皂苷可顯著抑制腫瘤細胞的增殖作用；重樓皂苷作用24h后能引發(fā)SGC-7901細胞〔Ca2+〕i的明顯增加。結論重樓皂苷可能通過增加細胞內〔Ca2+〕i誘導細胞凋亡，從而發(fā)揮其抗SGC-
2、7901細胞增殖的作用?！娟P鍵詞】重樓皂苷激光掃描共聚焦顯微鏡凋亡 重樓又名“七葉一枝花”，為植物根莖，是云南白藥的主要組成成分，具有止血、免疫調節(jié)、抗腫瘤、抗炎、抗病毒等廣泛藥理作用，其具生物活性的主要成分是多種甾體皂苷。目前，中藥重樓及其復方抗腫瘤作用機制多集中在細胞毒和調節(jié)機體免疫功能等方面〔1，2〕。本研究的目的在于探討重樓皂苷是否通過誘導細胞凋亡這一途徑而發(fā)揮其抑制腫瘤細胞增殖的作用?！ ?材料與儀器 1.1藥品與試劑 重樓皂苷（天津市中藥飲片廠）；Fluo-3/AM（sigma公司）?！?/p>
3、 1.2儀器 ALISEI隨機型全自動酶標板分析儀（意大利RAPIM集團）；低溫超速立式離心機（TomySeikoCo.Ltd,MRX-150型）；激光掃描共聚焦顯微鏡（美國伯樂公司，Bio-radRadiance2000）?！ ?方法 2.1MTT法測定 重樓皂苷對腫瘤細胞生長的抑制實驗〔3〕將濃度為5×104/ml的SGC-7901細胞懸液接種于96孔板中，培養(yǎng)24h后，加入重樓皂苷藥液使其終濃度分別為5，10，20，40，80μg/ml，同時設陰性對照組、順鉑陽性對照組，每組5個平行孔，37℃
4、、5％CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24，48，72h后，離心棄上清液，加入MTT繼續(xù)培養(yǎng)4h，離心棄上清液后加入鹽酸異丙醇振蕩10min，應用酶標儀于490nm處測吸光度值（A）。按公式計算細胞生長抑制率。實驗重復3次。生長抑制率（%）=(對照組OD值－用藥組OD值)/對照組OD值×100%?！ ?.2激光共聚焦觀察重樓皂苷對SGC-7901細胞內〔Ca2＋〕i的影響〔4〕 2.2.1SGC－7901細胞株的處理 分別設不同濃度重樓皂苷藥物組與陰性對照組，SGC-7901細胞以3×106/ml接種于六孔板中
5、的載玻片上，培養(yǎng)24h后，加入重樓皂苷藥液使其終濃度分別為5，10，20，40μg/ml，和不加藥液的細胞培養(yǎng)基作為對照組，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，用PBS液漂洗細胞。將載玻片放入Petri皿中，加入10μmol/LFlu－3／AM應用液，37℃下孵育細胞約40min，用PBS液洗脫細胞外未結合的熒光，再于37℃下保溫約10min，LSCM下觀察?！ ?.2.2LSCM動態(tài)觀察 重樓皂苷對SGC-7901細胞內〔Ca2＋〕i的變化〔5〕LSCM觀察負載Fluo-3／AM的SGC-7901細胞未給藥時細胞內熒光
6、強度，即〔Ca2＋〕i水平，時間300S；棄上清液，加入重樓皂苷終濃度為10μg/ml的藥液，孵箱內孵育10min后，上機觀察SGC－7901細胞內〔Ca2＋〕i變化，觀察時間300S；同法操作，觀察藥物濃度為20，40μg/ml時對細胞內〔Ca2＋〕i的影響?！ ?.2.3LSCM靜態(tài)觀察 重樓皂苷處理24h后SGC-7901細胞內〔Ca2＋〕i的變化LSCM觀察負載Fluo-3／AM的SGC-7901細胞給藥及未給藥時細胞內的熒光強度，即〔Ca2＋〕i水平，激發(fā)波長為488nm，檢測波長為530nm
7、，每組隨機取5個視野，計算細胞總數(shù)及總熒光強度（FI）值，取其平均值代表平均細胞內〔Ca2＋〕i?！ ?.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行處理，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，實驗結果采用t檢驗?！ ?結果 3.1重樓皂苷對SGC-7901細胞生長增殖的抑制作用 重樓皂苷對SGC-7901腫瘤細胞具有明顯的生長抑制作用，且呈劑量、時間依賴關系。結果見表1。表1重樓皂苷對體外培養(yǎng)的SGC-7901細胞的抑制作用（略） 3.2LSCM觀察腫瘤細胞內鈣離子強度的變化 LSCM動態(tài)觀察〔Ca2＋〕i濃
8、度的變化，對照組及重樓皂苷處理組細胞內〔Ca2＋〕i濃度隨掃描時間的延長均有緩慢上升趨勢；但在同一掃描時段，藥物處理后細胞內〔Ca2＋〕i濃度與對照組比較沒有統(tǒng)計學意義，即不同濃度的重樓皂苷對細胞內鈣離子的動態(tài)變化沒有影響。結果見表2。表2重樓皂苷對SGC－7901細胞〔Ca2＋〕i作用的動態(tài)變化（略）表3重樓皂苷處理24h后SGC-7901細胞內〔Ca2＋〕i的靜態(tài)變化（略） 4討論 重樓為百合科植物云南重樓或七葉一枝花
