胃痞消對(duì)脾虛型慢性萎縮性胃炎癌前病變大鼠胃黏膜上

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1、胃痞消對(duì)脾虛型慢性萎縮性胃炎癌前病變大鼠胃黏膜上【摘要】【目的】觀察健脾化瘀解毒中藥胃痞消(由黃芪、太子參、白術(shù)、丹參、白花蛇舌草等組成)對(duì)脾虛型慢性萎縮性胃炎(CAG)癌前病變大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞的增殖周期分布及凋亡基因表達(dá)的影響?！痉椒ā窟x用SD大鼠，隨機(jī)分為6組，即正常對(duì)照組，模型組，胃痞消高、中、低劑量組(劑量分別為15、75、375g·kg-1·d-1)，維酶素組(劑量為027g·kg-1·d-1)。除正常對(duì)照組外，其他組均采用N甲基N′硝基N亞硝基胍(MNNG)液自由飲用結(jié)合饑飽失常加耗氣瀉下法復(fù)制脾虛型CAG胃癌前病變模型,觀察胃痞消各劑量組連續(xù)治療4周后對(duì)大

2、鼠胃黏膜上皮細(xì)胞增殖周期分布、凋亡率、凋亡基因p53、Bcl2和Bax表達(dá)的影響?！窘Y(jié)果】胃痞消各劑量組可顯著增加胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡率，增加G0/G1期、減少S期細(xì)胞分布,促進(jìn)p53表達(dá),抑制Bcl2表達(dá)(均P<001),胃痞消高劑量組可顯著促進(jìn)Bax表達(dá)(P<005)。【結(jié)論】胃痞消可抑制CAG癌前病變大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞的增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能與其能促進(jìn)p53和Bax表達(dá),抑制Bcl2表達(dá)有關(guān)。　　【關(guān)鍵詞】胃痞消/藥理學(xué);癌前狀態(tài)/中藥療法;胃腫瘤;細(xì)胞周期;基因表達(dá)調(diào)控;疾病模型，動(dòng)物;大鼠　　胃癌同其他腫瘤一樣,很少?gòu)恼＝M織發(fā)生癌變,單純的慢性萎縮

3、性胃炎(CAG)與胃癌的發(fā)生可能無(wú)直接關(guān)系,而在CAG基礎(chǔ)上發(fā)生的腸上皮化生及異型增生,則是胃癌發(fā)生的組織學(xué)基礎(chǔ)[1]。因此CAG胃癌前病變(PLGC)大鼠模型均采用長(zhǎng)期CAG法進(jìn)行復(fù)制。本文擬通過(guò)觀察健脾化瘀解毒中藥胃痞消對(duì)脾虛型CAG模型大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡和增殖周期分布,以及凋亡基因表達(dá)的影響,探討中藥逆轉(zhuǎn)CAG并阻斷CAG癌變的分子機(jī)制,現(xiàn)報(bào)道如下。　　1材料與方法　　11實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠77只,體質(zhì)量60～80g,雌雄各半,由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào)：SCXK(粵)20030001;飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)環(huán)境：廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF實(shí)驗(yàn)室,實(shí)驗(yàn)環(huán)境合

4、格證號(hào)：0008252。　　12藥品、試劑及儀器N甲基N′硝基N亞硝基胍(MNNG)由日本東京株氏會(huì)社提供,藻紅蛋白(phycoerythrin,PE)標(biāo)記抗大鼠p53單克隆抗體、PE標(biāo)記大抗鼠Bax單克隆抗體均為美國(guó)Dako公司產(chǎn)品,PE標(biāo)記抗大鼠Bcl2單克隆抗體為美國(guó)Zymed公司產(chǎn)品,PE標(biāo)記的二抗羊抗鼠異硫氰酸熒光素標(biāo)記IgG抗體(FITCIgG)為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。胃痞消(由黃芪、太子參、白術(shù)、丹參、白花蛇舌草等組成)由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供并鑒定,維酶素由張家港制藥廠生產(chǎn)(批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H46020296)。Facstarplus型流

5、式細(xì)胞儀為美國(guó)BectonDickinson公司產(chǎn)品?！　?3分組及脾虛型CAG模型復(fù)制將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(10只)，模型組(15只)，維酶素組(13只，劑量為027g·kg-1·d-1,1倍成人臨床等效劑量[2],下同)，胃痞消高劑量組(13只,劑量為15g·kg-1·d-1,2倍成人臨床等效劑量)、中劑量組(13只,劑量為75g·kg-1·d-1,1倍成人臨床等效劑量)和低劑量組(13只,劑量為375g·kg-1·d-1,05倍成人臨床等效劑量)。除正常對(duì)照組予以正常飲食外，其他組均采用MNNG液自由飲用法[3]復(fù)制CAG大鼠模型：先用滅菌自來(lái)水將MNNG配制成10g

6、/mL濃度的儲(chǔ)存液,避光冷藏保存,臨用時(shí)將其配成150μg/mL的飲用液,裝入200mL的飲水瓶中,外貼黑色避光紙,整個(gè)配制過(guò)程全部避光操作。在此基礎(chǔ)上結(jié)合經(jīng)典的饑飽失常加耗氣瀉下法復(fù)制脾虛證[4],連續(xù)12周?！　?4給藥方法于實(shí)驗(yàn)第8周末,從模型組中隨機(jī)取2只大鼠,取胃組織,常規(guī)蘇木素—伊紅(HE)染色,光鏡下觀察到2只大鼠均有胃黏膜萎縮性病變,確認(rèn)模型復(fù)制成功后,所有治療組于第9周開始灌胃給藥,正常對(duì)照組和模型組均灌服等容積滅菌自來(lái)水,1次/d,連續(xù)4周。于第12周末,禁食禁水12h后處死,取外周抗凝血10mL,-80℃保存?zhèn)溆??！　?5單細(xì)胞懸液的制備取新鮮胃黏膜組織約4g,

7、除去表面黏液,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次,盡量洗盡組織中的血液,在平面皿上剪成肉糜狀,置300目銅網(wǎng)一邊用眼科鑷手背側(cè)輕輕摩擦組織于銅網(wǎng)表面,一邊將PBS洗搓下的細(xì)胞放入試管內(nèi),在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、95%相對(duì)濕度下孵育4h。在4℃、1500r/min條件下離心7min,棄上清液,重復(fù)2次,調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/mL,制成單細(xì)胞懸液。　　16誘導(dǎo)胃癌前病變組織細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)將上述制備的單細(xì)胞懸液,用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇