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《肺炎鏈球菌候選蛋白疫苗clpp的保守性和抗原性》由會(huì)員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫(kù)。
1、肺炎鏈球菌候選蛋白疫苗ClpP的保守性和抗原性作者:李岱容,曹炬,王虹,吳凱峰,尹一兵【摘要】目的:評(píng)價(jià)酪蛋白裂解酶P(ClpP)作為候選疫苗的保守性和抗原性,分析在不同血清型肺炎鏈球菌(SPN)中的表達(dá)情況.方法:以TIGR4型SPN的ClpP基因序列設(shè)計(jì)引物,分別以12株不同血清型SPN的基因組DNA為模板,對(duì)ClpP基因進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增、膠回收產(chǎn)物與PMD18克隆載體連接后進(jìn)行測(cè)序,運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)其核苷酸及推測(cè)的氨基酸序列及抗原性進(jìn)行分析,并利用CC(B)31109(serotype1),CMCC(B)31203(
2、serotype3),CMCC(B)31446(serotype4),CMCC(B)31011(serotype5),CMCC(B)31207(serotype6B),CMCC(B)31507(serotype7F),CMCC(B)31216(serotype9V),CMCC(B)31614(serotype14),CMCC(B)31687(serotype18C),CMCC(B)31693(serotype19F),CMCC(B)31759(serotype23F)(北京中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心),NCTC7466(serotype2,國(guó)際
3、通用名為D39)(歐洲國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)菌種庫(kù));大腸桿菌DH5a和原核表達(dá)系統(tǒng)(含pET32a(+)/ClpP重組質(zhì)粒)E.coliBL21(DE3)(重慶醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室),金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(重慶醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室),質(zhì)粒PMD18T載體試劑盒(日本TaKaRa公司).1.1.2試劑DNA提取試劑盒,凝膠回收試劑盒及日常型質(zhì)粒DNA快速制備試劑盒(上海華舜公司);限制性內(nèi)切酶EcoRI,SacI,高保真LATaq聚合酶,dNTPs,Buffer,MgCl2(大連寶生物技術(shù)公司);丙烯酰胺,雙丙烯酰胺,異丙基βD硫代
4、半乳糖苷(IPTG),完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)(美國(guó)Sigma公司);DNAmarker(上海生工公司);GoatantimouseIgGHRP(H+L)和3二氨基苯聯(lián)胺DAB∶3(北京中杉公司);咪唑,Nacl和Tris堿(美國(guó)BBI公司);HisBindColumn(NiNTA)鎳柱(美國(guó)Novagen公司).1.1.3儀器熱循環(huán)儀(TMBioRadPCR,美國(guó)genecycle公司);電泳儀(Pomol/L)2.4μL,P1(5pmol/L)3μL,P2(5pmol/L)3μL,SPNDNA1.5μL,
5、LATaq0.4μL.在PCR儀上按下列條件進(jìn)行擴(kuò)增:95℃預(yù)熱5min后反應(yīng)30個(gè)周期:94℃1min,53℃1min,72℃1min.末輪后72℃延伸5min.取5μL反應(yīng)產(chǎn)物置10g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定后,DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物.1.2.2TA克隆載體的構(gòu)建與鑒定將回收純化的12個(gè)PCR產(chǎn)物克隆至PMD18T載體,轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞,在Amp+LB平板上培養(yǎng)得到多個(gè)陽(yáng)性克隆,單個(gè)陽(yáng)性克隆細(xì)菌經(jīng)增菌后進(jìn)行質(zhì)粒抽提后雙酶切鑒定,并將質(zhì)粒送往重慶醫(yī)科大學(xué)感染實(shí)驗(yàn)室做雙向測(cè)序.1.2.3序列比對(duì)與氨基酸序列預(yù)測(cè)利用DNAssi
6、st軟件,將12個(gè)重組克隆質(zhì)粒雙向測(cè)序的結(jié)果及預(yù)測(cè)的氨基酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)已公布的TIGR4SPN全基因組序列進(jìn)行相似性分析.1.2.4抗原表位預(yù)測(cè)用抗原表位預(yù)測(cè)工具ANTIGENICPREDICTEDANTIGENICPEPTIDES分析不同血清型SPNClpP蛋白的抗原表位及其氨基酸組成.1.2.5PETClpP重組載體的誘導(dǎo)表達(dá)及純化原核表達(dá)系統(tǒng)pET32a(+)/ClpPE.coliBL21(DE3)在終濃度1mmol/LIPTG,37℃,250r/min條件下誘導(dǎo)目的重組蛋白ClpP的表達(dá).收集的菌體超聲波碎菌后,采
7、用NiNTA柱純化目的蛋白,以SDSPAGE和BioRad凝膠圖像分析系統(tǒng)檢查目的重組蛋白表達(dá)與提純效果.將透析除鹽的純化蛋白溶液經(jīng)Bradford法定量后備用.1.2.6antiClpP抗血清的制備稀釋后重組clpP蛋白溶液與等體積的CFA或IFA充分混勻成乳狀,在小鼠腹腔下接種制備好的抗原蛋白.初次免疫時(shí)小鼠接受含200μL(含重組蛋白10μg)的CFA與重組蛋白混合物;小鼠再次與末次免疫時(shí)接受200μL(含重組蛋白10μg)的IFA與重組蛋白混合物.小鼠經(jīng)3次免疫后,分離小鼠血清,并用ELISA法測(cè)其antiClpP抗體效價(jià).1
8、.2.7D18T載體,同時(shí)菌落PCR結(jié)果也證明基因克隆正確.2.3測(cè)序結(jié)果與序列比對(duì)不同株的ClpP基因編碼區(qū)大小與TIGR4菌株中ClpP基因一樣,均為591b