肺炎鏈球菌候選蛋白疫苗clpp的保守性和抗原性

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1、肺炎鏈球菌候選蛋白疫苗ClpP的保守性和抗原性作者：李岱容，曹炬，王虹，吳凱峰，尹一兵【摘要】目的:評(píng)價(jià)酪蛋白裂解酶P(ClpP)作為候選疫苗的保守性和抗原性，分析在不同血清型肺炎鏈球菌（SPN）中的表達(dá)情況.方法:以TIGR4型SPN的ClpP基因序列設(shè)計(jì)引物，分別以12株不同血清型SPN的基因組DNA為模板，對(duì)ClpP基因進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增、膠回收產(chǎn)物與PMD18克隆載體連接后進(jìn)行測(cè)序，運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)其核苷酸及推測(cè)的氨基酸序列及抗原性進(jìn)行分析，并利用CC(B)31109(serotype1)，CMCC(B)31203(

2、serotype3)，CMCC(B)31446(serotype4)，CMCC(B)31011(serotype5)，CMCC(B)31207(serotype6B)，CMCC(B)31507(serotype7F)，CMCC(B)31216(serotype9V)，CMCC(B)31614(serotype14)，CMCC(B)31687(serotype18C)，CMCC(B)31693(serotype19F)，CMCC(B)31759(serotype23F)（北京中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心），NCTC7466(serotype2，國(guó)際

3、通用名為D39)（歐洲國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)菌種庫(kù)）；大腸桿菌DH5a和原核表達(dá)系統(tǒng)(含pET32a(+)/ClpP重組質(zhì)粒)E.coliBL21(DE3)(重慶醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)，金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(重慶醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室)，質(zhì)粒PMD18T載體試劑盒(日本TaKaRa公司).1.1.2試劑DNA提取試劑盒，凝膠回收試劑盒及日常型質(zhì)粒DNA快速制備試劑盒(上海華舜公司)；限制性內(nèi)切酶EcoRI，SacI，高保真LATaq聚合酶，dNTPs，Buffer，MgCl2(大連寶生物技術(shù)公司)；丙烯酰胺，雙丙烯酰胺，異丙基βD硫代

4、半乳糖苷(IPTG)，完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)(美國(guó)Sigma公司)；DNAmarker(上海生工公司)；GoatantimouseIgGHRP(H+L)和3二氨基苯聯(lián)胺DAB∶3(北京中杉公司)；咪唑，Nacl和Tris堿(美國(guó)BBI公司)；HisBindColumn(NiNTA)鎳柱(美國(guó)Novagen公司).1.1.3儀器熱循環(huán)儀（TMBioRadPCR，美國(guó)genecycle公司）；電泳儀（Pomol/L)2.4μL，P1(5pmol/L)3μL，P2(5pmol/L)3μL，SPNDNA1.5μL，

5、LATaq0.4μL.在PCR儀上按下列條件進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)熱5min后反應(yīng)30個(gè)周期：94℃1min，53℃1min，72℃1min.末輪后72℃延伸5min.取5μL反應(yīng)產(chǎn)物置10g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物.1.2.2TA克隆載體的構(gòu)建與鑒定將回收純化的12個(gè)PCR產(chǎn)物克隆至PMD18T載體，轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在Amp+LB平板上培養(yǎng)得到多個(gè)陽(yáng)性克隆，單個(gè)陽(yáng)性克隆細(xì)菌經(jīng)增菌后進(jìn)行質(zhì)粒抽提后雙酶切鑒定，并將質(zhì)粒送往重慶醫(yī)科大學(xué)感染實(shí)驗(yàn)室做雙向測(cè)序.1.2.3序列比對(duì)與氨基酸序列預(yù)測(cè)利用DNAssi

6、st軟件，將12個(gè)重組克隆質(zhì)粒雙向測(cè)序的結(jié)果及預(yù)測(cè)的氨基酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)已公布的TIGR4SPN全基因組序列進(jìn)行相似性分析.1.2.4抗原表位預(yù)測(cè)用抗原表位預(yù)測(cè)工具ANTIGENICPREDICTEDANTIGENICPEPTIDES分析不同血清型SPNClpP蛋白的抗原表位及其氨基酸組成.1.2.5PETClpP重組載體的誘導(dǎo)表達(dá)及純化原核表達(dá)系統(tǒng)pET32a(+)/ClpPE.coliBL21(DE3)在終濃度1mmol/LIPTG，37℃，250r/min條件下誘導(dǎo)目的重組蛋白ClpP的表達(dá).收集的菌體超聲波碎菌后，采

7、用NiNTA柱純化目的蛋白，以SDSPAGE和BioRad凝膠圖像分析系統(tǒng)檢查目的重組蛋白表達(dá)與提純效果.將透析除鹽的純化蛋白溶液經(jīng)Bradford法定量后備用.1.2.6antiClpP抗血清的制備稀釋后重組clpP蛋白溶液與等體積的CFA或IFA充分混勻成乳狀，在小鼠腹腔下接種制備好的抗原蛋白.初次免疫時(shí)小鼠接受含200μL(含重組蛋白10μg)的CFA與重組蛋白混合物；小鼠再次與末次免疫時(shí)接受200μL(含重組蛋白10μg)的IFA與重組蛋白混合物.小鼠經(jīng)3次免疫后，分離小鼠血清，并用ELISA法測(cè)其antiClpP抗體效價(jià).1

8、.2.7D18T載體，同時(shí)菌落PCR結(jié)果也證明基因克隆正確.2.3測(cè)序結(jié)果與序列比對(duì)不同株的ClpP基因編碼區(qū)大小與TIGR4菌株中ClpP基因一樣，均為591b