肺炎鏈球菌候選蛋白疫苗clpp的保守性的論文

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1、肺炎鏈球菌候選蛋白疫苗ClpP的保守性的論文【摘要】目的:評價(jià)酪蛋白裂解酶p(clpp)作為候選疫苗的保守性和抗原性，分析在不同血清型肺炎鏈球菌（spn）中的表達(dá)情況.方法:以tigr4型spn的clpp基因序列設(shè)計(jì)引物，分別以12株不同血清型spn的基因組dna為模板，對clpp基因進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)擴(kuò)增、膠回收產(chǎn)物與pmd18克隆載體連接后進(jìn)行測序，運(yùn)用生物信息學(xué)方法對其核苷酸及推測的氨基酸序列及抗原性進(jìn)行分析，并利用oniae，spn）是引起獲得性肺炎、中耳炎、鼻竇炎的主要病原菌.隨著多重耐藥菌株的不斷發(fā)現(xiàn)，疫苗在預(yù)防和控制spn感染中的作

2、用越來越重要［1］.spn根據(jù)莢膜可分為90多個(gè)血清型，開發(fā)對所有血清型spn都具抵抗作用的高保守性蛋白疫苗是目前spn疫苗的發(fā)展方向.研究發(fā)現(xiàn)的spn蛋白質(zhì)候選疫苗酪蛋白裂解酶p(caseinolyticproteasep,clpp）是atp依賴的絲氨酸蛋白水解酶［2］，其在spn的生存、致病和入血過程中起著重要的作用［3-4］，針對其靶點(diǎn)的疫苗或抗生素也越來越顯示出其潛在的價(jià)值.本研究探討clpp在不同spn菌株中的保守性與抗原性，以及在不同血清型spn中表達(dá)情況，旨在為自主開發(fā)spn蛋白疫苗奠定基礎(chǔ).1材料和方法1.1材料1.1.1菌種與質(zhì)粒12株不

3、同血清型spn：cmcc(b)31109(serotype1)，cmcc(b)31203(serotype3)，cmcc(b)31446(serotype4)，cmcc(b)31011(serotype5)，cmcc(b)31207(serotype6b)，cmcc(b)31507(serotype7f)，cmcc(b)31216(serotype9v)，cmcc(b)31614(serotype14)，cmcc(b)31687(serotype18c)，cmcc(b)31693(serotype19f)，cmcc(b)31759(serotype23f)

4、（北京中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心），nctc7466(serotype2，國際通用名為d39)（歐洲國家標(biāo)準(zhǔn)菌種庫）；大腸桿菌dh5a和原核表達(dá)系統(tǒng)(含pet32a(+)/clpp重組質(zhì)粒)e.colibl21(de3)(重慶醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)，金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(重慶醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室)，質(zhì)粒pmd18t載體試劑盒(日本takara公司).1.1.2試劑dna提取試劑盒，凝膠回收試劑盒及日常型質(zhì)粒dna快速制備試劑盒(上海華舜公司)；限制性內(nèi)切酶ecori，saci，高保真lataq聚合酶，dntps，buffer，mgcl2(大

5、連寶生物技術(shù)公司)；丙烯酰胺，雙丙烯酰胺，異丙基βd硫代半乳糖苷(iptg)，完全弗氏佐劑(cfa)和不完全弗氏佐劑(ifa)(美國sigma公司)；dnamarker(上海生工公司)；goatantimouseigghrp(h+l)和3二氨基苯聯(lián)胺dab∶3(北京中杉公司)；咪唑，nacl和tris堿(美國bbi公司)；hisbindcolumn(ninta)鎳柱(美國novagen公司).1.1.3儀器熱循環(huán)儀（tmbioradpcr，美國genecycle公司）；電泳儀（pog2+)6.0μl，dntp(10mmol/l)2.4μl，

6、p1(5pmol/l)3μl，p2(5pmol/l)3μl，spndna1.5μl，lataq0.4μl.在pcr儀上按下列條件進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)熱5min后反應(yīng)30個(gè)周期：94℃1min，53℃1min，72℃1min.末輪后72℃延伸5min.取5μl反應(yīng)產(chǎn)物置10g/l瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，dna膠回收試劑盒回收pcr產(chǎn)物.1.2.2ta克隆載體的構(gòu)建與鑒定將回收純化的12個(gè)pcr產(chǎn)物克隆至pmd18t載體，轉(zhuǎn)入dh5α感受態(tài)細(xì)胞，在amp+lb平板上培養(yǎng)得到多個(gè)陽性克隆，單個(gè)陽性克隆細(xì)菌經(jīng)增菌后進(jìn)行質(zhì)粒抽提后雙酶切鑒定，并將質(zhì)粒送往重慶醫(yī)科大學(xué)感

7、染實(shí)驗(yàn)室做雙向測序.1.2.3序列比對與氨基酸序列預(yù)測利用dnassist軟件，將12個(gè)重組克隆質(zhì)粒雙向測序的結(jié)果及預(yù)測的氨基酸序列與genbank數(shù)據(jù)庫對已公布的tigr4spn全基因組序列進(jìn)行相似性分析.1.2.4抗原表位預(yù)測用抗原表位預(yù)測工具antigenicpredictedantigenicpeptides（<ahref="bio.dfci.harvard.edu/tools/）分析不同血清型spn"target=_blankclpp蛋白的抗原表位及其氨基酸組成.>bio.dfci.harvard.edu/tools/）分析不同血清型

8、spnclpp蛋白的抗原表位及其氨基酸組成.1.2.5petcl