資源描述：
《人參皂苷對(duì)體外培養(yǎng)低氧海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用論文》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫(kù)。
1、人參皂苷對(duì)體外培養(yǎng)低氧海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用論文王雙燕王守彪沈若武李安慶楊學(xué)偉【關(guān)鍵詞】人參［摘要］目的觀察人參皂苷（Rg2）對(duì)大鼠低氧海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法取新生EM、馬血清購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清由杭州四季青生物材料工程公司生產(chǎn)；多聚賴氨酸為Sigma公司產(chǎn)品。1.1.3主要儀器設(shè)備及來(lái)源OLYMPUS，BX50，PM20系統(tǒng)顯微鏡（日本）；PM6OLYMPUS解剖顯微鏡（日本）；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；超凈工作臺(tái)（YJ型，蘇州市潔凈技術(shù)研究所）。1.2方法1.2.1海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)采用文獻(xiàn)［5］的細(xì)胞培養(yǎng)方法。取新生1~3d的）15μL（終濃度
2、為5μmol/L），經(jīng)37℃恒溫水浴振蕩孵育30min，以1000r/min離心10min后，棄去上清，加入羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）溶液2mL，吹打沉淀制成懸液。重復(fù)上述步驟，最后制成2mL重懸液，熒光分光光度計(jì)測(cè)500nm處的發(fā)射波長(zhǎng)，300~400nm激發(fā)波長(zhǎng)測(cè)定吸光度(A)。并按文獻(xiàn)［7］所提供的公式計(jì)算Ca2+含量(［Ca2+］i)。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用CS2000軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若方差不齊，則先行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換或用秩和檢驗(yàn)；若方差齊，則進(jìn)行F檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1細(xì)胞存活率的計(jì)算分離出的海馬細(xì)胞在接種之前，制備109/L細(xì)胞懸液，用2g/L臺(tái)盼藍(lán)染色，顯微鏡下觀察
3、，死亡細(xì)胞呈藍(lán)色，活細(xì)胞不著色，細(xì)胞存活率為97%。2.2神經(jīng)元的鑒定經(jīng)尼氏染色，光學(xué)顯微鏡下觀察，可見(jiàn)海馬神經(jīng)元胞質(zhì)染藍(lán)色，胞核無(wú)著色，表現(xiàn)為空泡狀核的典型特征。2.3細(xì)胞形態(tài)光學(xué)顯微鏡下，可見(jiàn)對(duì)照組大部分細(xì)胞核固縮、邊集或破碎，染色變深，細(xì)胞膜皺褶、卷曲、出泡。尼莫地平組少量的細(xì)胞核固縮、邊集或碎裂。Rg21組仍有一部分細(xì)胞核固縮、邊集、破裂，但數(shù)量已經(jīng)很少。Rg22組的大部分細(xì)胞核染成藍(lán)紫色，胞漿淡粉色。每組隨機(jī)選擇10個(gè)視野，計(jì)算細(xì)胞死亡率，對(duì)照組細(xì)胞死亡率明顯高于Rg21、2組，以Rg22組最低，差異有顯著性（χ2=3.37，P0.05），見(jiàn)表1。2.4各組海馬神經(jīng)元內(nèi)［Ca2
4、+］i比較對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i最高，尼莫地平組細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i僅次于對(duì)照組，且均明顯高于Rg21、2組，以Rg22組最低，差異有顯著性（F＝466.58,q=6.76~48.82，P0.01）。見(jiàn)表1。表1Rg2對(duì)低氧損傷海馬神經(jīng)元細(xì)胞死亡率以及［Ca2+］i的影響（略）3討論海馬是腦內(nèi)對(duì)缺血、低氧最為敏感的部位之一。本實(shí)驗(yàn)采用新生大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)，建立低氧損傷細(xì)胞模型，通過(guò)加入阿糖胞苷，可有效地抑制膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)，保證神經(jīng)元的純度，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色檢查，細(xì)胞存活率達(dá)97％，符合細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的要求。在腦低氧損傷機(jī)制的研究中，目前最受重視的是興奮性氨基酸毒性作用及胞內(nèi)鈣超載學(xué)說(shuō)。低
5、氧引起突觸前興奮性氨基酸大量釋放，過(guò)度激活突觸后電壓依賴性NMDA受體門(mén)控通道，引起細(xì)胞外Ca2+大量?jī)?nèi)流，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，干擾線粒體的氧化磷酸化過(guò)程；細(xì)胞漿Ca2+濃度升高被認(rèn)為是凋亡的第二信使，它可以激活某些蛋白酶、內(nèi)源性核酸酶和磷脂酶，這些酶的激活使細(xì)胞核結(jié)構(gòu)受到破壞，從而造成神經(jīng)元損傷。因此，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載被認(rèn)為是神經(jīng)元低氧損傷的最后通路［8］。有研究表明，神經(jīng)元凋亡產(chǎn)生的可能機(jī)制與Ca2+超載有關(guān)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高是細(xì)胞凋亡的始動(dòng)因素，反之，如能阻止細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，則能減慢和抑制細(xì)胞凋亡［9］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低氧造成細(xì)胞凋亡，引起Ca2+內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)
6、Ca2+超載；而尼莫地平和Rg2可以減少Ca2+內(nèi)流，抑制細(xì)胞凋亡，以0.050mmol/LRg2組作用最為明顯。由于Fura2/AM與胞漿中的Ca2+有很高的親和力，兩者以1∶1結(jié)合形成Fura2Ca2+復(fù)合物。這一復(fù)合物的激發(fā)光譜高峰分別為380nm和340nm，且其發(fā)射光的熒光比值變化與Ca2+濃度成比例關(guān)系。因此，Ca2+濃度在10-3~10-5μmol/L時(shí)熒光發(fā)射強(qiáng)度與Ca2+濃度之間存在一定的函數(shù)關(guān)系［7］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組Ca2+濃度明顯高于其他3組。由此可見(jiàn)，低氧損傷了神經(jīng)元，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，細(xì)胞內(nèi)Ca2+顯著增加。而Rg2可抑制Ca2+內(nèi)流，有效地降低細(xì)
7、胞內(nèi)Ca2+含量。提示，Rg2可能通過(guò)抑制Ca2+內(nèi)流來(lái)保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞抗低氧的損傷。［
