阿司匹林抑制肺癌細(xì)胞增殖的實驗研究

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1、阿司匹林抑制肺癌細(xì)胞增殖的實驗研究作者：劉國華，陳燕明，馮一中【摘要】目的觀察阿司匹林在體外對肺腺癌細(xì)胞A549增殖的抑制作用。方法采用噻唑藍(lán)(MTT)法觀察阿司匹林及與奧沙利鉑聯(lián)用抑制A549細(xì)胞的增殖；采用流式細(xì)胞儀(FCM)觀察阿司匹林處理后A549細(xì)胞周期分布的變化；采用HE染色和DNA末端原位標(biāo)記染色技術(shù)(TUNEL)觀察阿司匹林處理后誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的作用。結(jié)果MTT顯示阿司匹林呈劑量依賴方式抑制A549細(xì)胞增殖。阿司匹林作用后，F(xiàn)CM顯示G0/G1期細(xì)胞比例增加，S期和G2/M期細(xì)胞比例降低，TUNEL顯示細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)由3.67%±1.15%

2、增加到26.33%±2.52%，呈一定劑量效應(yīng)關(guān)系。光鏡下可見典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化。阿司匹林(2.5mmol/L)與奧沙利鉑(≥6.25ug/mL)聯(lián)用可增強抑制A549增殖的作用，二者呈協(xié)同或相加作用。結(jié)論阿司匹林可抑制肺腺癌細(xì)胞A549的增殖，其影響細(xì)胞周期分布、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能是其重要的機制。阿司匹林及與奧沙利鉑聯(lián)用有顯著的協(xié)同抗增殖效應(yīng)?！娟P(guān)鍵詞】阿司匹林；肺癌；細(xì)胞增殖；奧沙利鉑ExperimentalStudyonInhibitiveEffecsofAspirinontheProliferationofHumanLungCancerCellsKeya公

3、司，實驗前先溶于無水乙醇，配制成1000X濃度，再用培養(yǎng)基稀釋1000倍，所有實驗組及對照組培養(yǎng)液內(nèi)乙醇終濃度均<0.5%，預(yù)實驗對細(xì)胞增殖沒有影響。奧沙利鉑由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)。RPMI1640培養(yǎng)液購自Gibco公司，含10%滅活小牛血清，100u/mL青霉素及100u/mL鏈霉素。噻唑藍(lán)(MTT)及二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司。RNA酶(Rnase)及碘化丙啶(PI)購自Sigma公司。原位酶標(biāo)記法(TUNEL)試劑盒購自Roche公司。1.1.3主要儀器美國SHELLAB2300型恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，日本OLYMPUSBH2型

4、光學(xué)顯微鏡，美國Biotect2550型自動酶標(biāo)光度儀，美國COULTEREPICSXL型流式細(xì)胞儀等。1.2方法1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將肺腺癌細(xì)胞株A549置于RPMI1640培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。1.2.2MTT比色法取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞以每孔5×103個細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)24h后換液，設(shè)實驗組(加不同濃度的干預(yù)藥物)、空白調(diào)零組(不接種細(xì)胞)及對照組(只含等量溶劑)，每組設(shè)四個復(fù)孔。48h后每孔加入MTT20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h后1000r/min離心5min，吸出上清液，每孔加入DMSO100μL，輕輕振蕩10min，于酶標(biāo)儀5

5、70nm波長處測定各孔吸光度值(A值)。計算細(xì)胞增殖的抑制率：抑制率=(1-實驗組A平均值/對照組A平均值)×100%。計算Q值并判斷兩藥的聯(lián)合效應(yīng)[2]：Q=E(A+B)/[EA+(1－EA)×EB]，其中E(A+B)為兩藥合用的抑制率，EA、EB為兩藥單用的抑制率。Q為0.85～1.15表示兩藥作用相加，Q>1.15表示兩藥作用協(xié)同，Q<0.85表示兩藥作用拮抗。1.2.3流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞按1×106/瓶個細(xì)胞接種于100mL培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24h后換液。實驗組阿司匹林終濃度分別為5.0mmol/L、10.0mmol/

6、L，設(shè)不加藥對照組,每組每個濃度重復(fù)3瓶。48h后收集細(xì)胞，吹打成細(xì)胞懸液，PBS洗滌，1000r/min離心5min后棄上清液，加入70%冷乙醇固定，4℃放置1h，取出后用PBS漂洗，1000r/min離心5min后棄上清液，加入0.01%Rnase1mL，37℃水浴溫箱振蕩10min，1000r/min離心5min后棄上清液，加入0.05%碘化丙啶(PI)1mL染色，用400目篩網(wǎng)過濾后置于4℃冰箱，20min后上機檢測。計算細(xì)胞增殖指數(shù)（PI）：PI=(S+G2M)/(G0/G1+S+G2M)×100%。1.2.4HE、TUNEL染色法檢測細(xì)胞凋亡(1)細(xì)胞形態(tài)

7、學(xué)觀察取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞以每孔2×104個細(xì)胞接種在置有玻片的24孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24h后換液。實驗組阿司匹林終濃度分別為5.0mmol/L、10.0mmol/L，設(shè)不加藥對照組，每組每個濃度設(shè)3個復(fù)孔。48h后取出玻片，冷丙酮固定30min，PBS漂洗，室溫風(fēng)吹干。作HE染色，光鏡下觀察。(2)DNA末端原位標(biāo)記染色法(TUNEL)按(1)制備腫瘤細(xì)胞玻片。48h后4%多聚甲醛固定30min，蛋白酶K消化，0.3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，加入TdT和BiodUTP混合液37℃孵育60min，SABC室溫30min，DAB顯色，蘇