青霉素高產(chǎn)菌株的理性篩選

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1、青霉素高產(chǎn)菌株的理性篩選作者：婁忻張莉劉靚張玉蓮陳麗華劉靜賀建功【摘要】以青霉素生產(chǎn)菌種87117#為出發(fā)菌種，采用紫外線誘變復(fù)合前體動(dòng)態(tài)后處理的方法，結(jié)合限氧條件下的搖瓶篩選，從177支前體抗性株中篩出XY-137#高產(chǎn)突變株。該菌株搖瓶效價(jià)平均提高了8.8%,且遺傳特性穩(wěn)定，單位菌絲產(chǎn)物合成能力強(qiáng)。XY-137#菌株在百噸罐中經(jīng)過近百批的生產(chǎn)驗(yàn)證，其放罐效價(jià)、發(fā)酵指數(shù)、罐批產(chǎn)量平均提高了3.83%、5.66%和2.69%?！娟P(guān)鍵詞】紫外誘變；動(dòng)態(tài)后處理；理性篩選；青霉素高產(chǎn)菌株ABSTRACTUsingPenicilliumchrysogenum#87117asstartingstrai

2、n,apenicillinhighyieldstrain#XY-137ethodunderlimitedoxygen.Penicillinpotencyofstrain#XY-137entationlevelentor.KEYutagenesis;Dynamicpost-treatment;Rationalscreening;Penicillinhigh-producingstrain由于青霉素原料的后加工與半合成領(lǐng)域愈來愈廣泛，世界青霉素市場競爭十分激烈。生產(chǎn)廠家唯有不斷地提高生產(chǎn)水平，降低生產(chǎn)成本以增強(qiáng)企業(yè)的競爭力，而優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)菌種的選育和應(yīng)用是其中的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。隨著青霉素菌種生產(chǎn)能力的提

3、高，傳統(tǒng)育種方法的局限性越來越明顯。理性化篩選是應(yīng)用遺傳學(xué)和生物化學(xué)的原理，根據(jù)已知或可能的目的產(chǎn)物生物合成途徑的調(diào)控機(jī)制和產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)篩選方法，定向選出有效的性狀突變株。我們依據(jù)理性育種的理念，參照現(xiàn)有生產(chǎn)條件設(shè)立基本篩選模型，采用紫外輻射震動(dòng)工業(yè)生產(chǎn)菌種穩(wěn)定的遺傳結(jié)構(gòu)，再輔以限氧條件下耐前體突變株的篩選，達(dá)到選育高產(chǎn)菌株的目的。1材料與方法1.1出發(fā)菌種青霉素生產(chǎn)菌種Penicilliumchrysogenum87117#。1.2培養(yǎng)基(1)分離及斜面培養(yǎng)基蔗糖、甘油、酵母粉、NaCl、CaSO4、微量元素、瓊脂。(2)種子培養(yǎng)基以蔗糖、玉米漿為碳、氮源。(3)發(fā)酵培養(yǎng)基以乳糖、

4、玉米漿為主要碳、氮源，加無機(jī)鹽類組成。1.3菌種誘變與篩選(1)紫外誘變將出發(fā)菌株的單孢子懸液置紫外燈下40cm處照射90s。(2)前體動(dòng)態(tài)后處理定量吸取經(jīng)過紫外線照射后的孢子液，分別加入含有不同劑量的前體(苯乙酸胺)的種子培養(yǎng)基試管中，使每支試管的前體終濃度在0～4.8%之間。將上述試管置25℃恒溫振蕩培養(yǎng)18h左右，然后稀釋分離在固體培養(yǎng)基平板上。(3)前體抗性菌落檢出平板置25℃恒溫培養(yǎng)8d。從耐受不同濃度前體處理后長出的抗性菌落中挑選孢子相對豐富、組織比較致密的菌落進(jìn)行斜面?zhèn)鞔囵B(yǎng)，以備搖瓶篩選。(4)搖瓶定向篩選低氧耗、低菌絲量的高產(chǎn)菌株將搖瓶機(jī)轉(zhuǎn)速由通常的220r/min降至16

5、0r/min，在低通氣條件下進(jìn)行搖瓶篩選。后續(xù)的高產(chǎn)株特性考察和工藝優(yōu)化均在此條件下進(jìn)行。搖瓶篩選考察指標(biāo)為發(fā)酵效價(jià)和菌絲生長量(packedmycelialvolume,pmv)。1.4樣品檢測發(fā)酵液倒入刻度離心管中，3000r/min離心10min。取上清液，用美國OI公司Flol)。沉淀部分所占體積與發(fā)酵液體積的比值即為pmv(%)。2結(jié)果2.1XY-137#高產(chǎn)突變株的選育出發(fā)菌株87117#先經(jīng)過兩次自然選育，然后采用紫外線復(fù)合前體動(dòng)態(tài)后處理，挑取177支抗性株，在限氧條件下進(jìn)行搖瓶篩選。于3.84%前體耐受濃度下獲得XY-137#高產(chǎn)突變株，以87117#為對照，其5d和7d搖瓶

6、相對效價(jià)分別為107.4%和110.3%，搖瓶效價(jià)平均提高了8.8%。2.2XY-137#菌株特性考察(1)菌種純度XY-137#菌株自然分離后正常型菌落達(dá)96.3%，符合上生產(chǎn)罐的要求。(2)斜面周期XY-137#與出發(fā)菌株相比其斜面外觀有所改變，孢子長勢較弱，顏色明顯變淺。若仍按原周期培養(yǎng)斜面，則種子瓶的培養(yǎng)時(shí)間需延長4～6h。經(jīng)過試驗(yàn)比較，將斜面培養(yǎng)周期推后1d，種子瓶生長正常，且搖瓶前期發(fā)酵效價(jià)略有提高。(3)單位菌絲產(chǎn)物合成能力由圖1可知，與出發(fā)菌種相比XY-137#菌株的搖瓶效價(jià)有顯著提高，而菌絲量較低，說明XY-137#菌株單位菌絲產(chǎn)量明顯優(yōu)于87117#對照菌種。1：8711

7、7#相對效價(jià)；2：XY-137#相對效價(jià)；3：87117#菌絲生長量；4：XY-137#菌絲生長量圖1XY-137#與87117#菌種搖瓶相對效價(jià)和菌絲量比較(4)穩(wěn)定性試驗(yàn)XY-137#菌株經(jīng)斜面?zhèn)鞔筮M(jìn)行搖瓶考察，F(xiàn)1～F4代相對效價(jià)依次為100%、98.9%、101.1%和99.7%，證明其穩(wěn)定性良好。2.3XY-137#菌株搖瓶工藝優(yōu)化(1)培養(yǎng)基改良進(jìn)行了多輪均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)。種子瓶經(jīng)回歸分析得到的最優(yōu)