溶菌酶高產(chǎn)菌株的篩選

《溶菌酶高產(chǎn)菌株的篩選》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。

1、溶菌酶高產(chǎn)菌株篩選及其產(chǎn)酶研究1、溶菌酶的分布目前已知溶菌酶在自然界中分布極為廣泛，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)高等動植物組織及分泌物、原生動物、昆蟲和各種微生物中都有溶菌酶存在如雞卵清中含有相當(dāng)量的溶菌酶（約3.4％至3.5％），此外，人體、蜜蜂、蚜蟲等均發(fā)現(xiàn)有溶菌酶動物溶菌酶植物溶菌酶微生物溶菌酶植物中的溶菌酶通常比動物來源的溶菌酶具有較大的分子量溶菌酶人們從上世紀(jì)６０年代發(fā)現(xiàn)微生物也產(chǎn)生溶菌酶，并且進展很快。溶菌酶可以用溶菌譜來作為酶專一性的主要指標(biāo)，但由于這類酶的作用機制十分復(fù)雜，所以這種分類并不能反映酶的作用本質(zhì)，現(xiàn)在以酶的作用性質(zhì)來進行分類。一般把微生

2、物產(chǎn)生的溶菌酶分為７類①內(nèi)．Ｎ．乙酰已糖胺酶②酰胺酶③內(nèi)肽酶（Peptidasc）和蛋白酶④β-1，3.β-1，6葡聚糖酶和甘露糖酶（葡甘露糖酶）⑤磷酸甘露糖酶⑥殼多糖酶⑦脫乙酰殼多糖酶2、溶菌酶菌株的篩選由于溶菌酶微生物的分布廣泛性，所以本課題從土壤微生物入手，從中篩選分離出溶菌酶高產(chǎn)菌株，并進行培養(yǎng)保存其中的土壤樣品是來自17個省市地區(qū)的各種植被類型土壤樣品156份主要培養(yǎng)基(l)指示菌培養(yǎng)基:蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaCl1%，pH值調(diào)至7.2-7.4，121℃滅菌20min。(2)初篩培養(yǎng)基及菌株的保存培養(yǎng)基:蛋白胨1%，牛肉膏0

3、.5%，NaCl1%，瓊脂1.5%-2%。pH值調(diào)至7.2-7.4，121℃滅菌20min。(3)基礎(chǔ)培養(yǎng)基:蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，NaCl1%。pH值調(diào)至7.2-7.4，121℃滅菌20min。(4)搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基:可溶性淀粉1.25%，牛肉膏2.5%，玉米漿1%，Tween0.1%，pH值調(diào)至7.0，121℃滅菌20min。產(chǎn)酶菌株的分離采用雙層平板法以金黃色葡萄球菌為指示菌，采用混菌方法制成下層培養(yǎng)基將土壤樣品充分研磨，梯度稀釋后，取1mL土壤懸液加入已經(jīng)凝固的下層培養(yǎng)基上，再倒入50℃營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，混勻，制成上層培養(yǎng)基28℃

4、培養(yǎng)，每天觀察并記錄下層：上層：又叫雙層瓊脂平板法先在培養(yǎng)皿中倒入底層固體培養(yǎng)基，凝固后再倒入含有宿主細(xì)菌和一定稀釋度噬菌體的半固體培養(yǎng)基。培養(yǎng)一段時間后，計算噬菌斑的數(shù)量。用滅菌牙簽挑取在初篩雙層平板上產(chǎn)生透明圈的菌落，進行劃線分離挑取單一菌落，點接到含金黃色葡萄球菌的驗證板上，37℃培養(yǎng)2d。觀察其是否再次產(chǎn)生透明圈，以及產(chǎn)圈穩(wěn)定性。將經(jīng)過驗證仍產(chǎn)透明圈的菌株進行純化并保存。高抑菌活性菌株的初步篩選將分離得到的具有抑菌活性的菌株進行搖瓶發(fā)酵，利用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，300mL三角瓶裝瓶量50mL，接種量2%，37℃，200rpm搖振培養(yǎng)。每8h

5、取發(fā)酵液，在含金黃色葡萄球菌的營養(yǎng)瓊脂平板上用直徑6mm無菌中空管打孔，注入50uL發(fā)酵液。37℃溫育24h。觀察結(jié)果并用游標(biāo)卡尺測量透明圈直徑。篩選抑菌圈較大的菌株。抑菌活性成分的初步鑒定將篩選到的具有較強抑菌活性菌株進行搖瓶發(fā)酵，取36h發(fā)酵液12000rpm、20min離心。取上清液進行蛋白酶K處理，20uL蛋白酶K(20mg/mL)加入500ul上清液中，50℃反應(yīng)1h，各取50匹在含有金黃色葡萄球菌的營養(yǎng)瓊脂板上打孔點樣，37℃培養(yǎng)24h觀察透明圈。將發(fā)酵液離心取上清進行透析濃縮，發(fā)酵液10mL加入透析袋(透過規(guī)格8一14.0KD)中

6、，扎緊，置于聚乙二醇20000中，4℃透析過夜。測定透析前后酶活力。溶菌酶高產(chǎn)菌株的復(fù)篩對初步鑒定抑菌活性成分是蛋白質(zhì)的高活力菌株進行搖瓶發(fā)酵試驗，測定溶菌酶活力，根據(jù)產(chǎn)酶活力，結(jié)合菌株特性，綜合確定篩選菌株。