乳酸菌菌種的分離篩選方法

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1、.乳酸菌菌種的分離篩選方法乳酸細(xì)菌是一類能利用發(fā)酵糖產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌通稱。為兼性厭氧菌，桿狀或球狀，革蘭氏陽性菌，無芽孢，不運(yùn)動(dòng)。營養(yǎng)要求高，需要提供豐富的肽類氨基酸維生素。在瓊脂表面或內(nèi)層形成較小的白色或淡黃色的菌落。通常用作為有益微生物的菌種有乳酸乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、糞腸球菌、乳酸片球菌、雙歧桿菌、屎腸球菌、戊糖片球菌等。乳桿菌常用MRS瓊脂作半選擇培養(yǎng)基。當(dāng)乳桿菌僅是復(fù)雜區(qū)系中的部分菌類時(shí)，SL培養(yǎng)基常用作為選擇性培養(yǎng)基。對(duì)于芽孢乳桿菌常用GYP培養(yǎng)基，鏈球菌有TYC培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基。M17培養(yǎng)基被用作乳球菌的分離培養(yǎng)基。嗜酸乳桿菌屬于乳桿菌

2、屬的一個(gè)種。其特性為：桿菌，兩端圓，不運(yùn)動(dòng)，無鞭毛。糞腸球菌為革蘭氏陽性，圓形或橢圓形。乳酸片球菌細(xì)胞呈球狀，直徑0.6~1.0μm，在直角兩個(gè)平面交替形成四聯(lián)狀，一般細(xì)胞成對(duì)生，單生者罕見，不成鏈狀排列。革蘭氏陽性，不運(yùn)動(dòng)，兼性厭氧。在MRS培養(yǎng)基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺線的生長物呈絲狀。乳酸菌在一般瓊脂培養(yǎng)基上形成微小菌落，不易觀察，所以分離時(shí)先富集培養(yǎng)并選擇合適的培養(yǎng)基。分離培養(yǎng)基一般添加西紅柿、酵母膏、吐溫-80等物質(zhì)，也常常加入醋酸鹽，因醋酸鹽能抑制部分細(xì)菌生長，對(duì)乳酸菌無害。培養(yǎng)基中添加碳酸鈣，乳酸溶解培養(yǎng)基中的碳酸鈣形成透明圈，作為分離鑒別的依據(jù)，通過對(duì)生成

3、的乳酸量進(jìn)行性能鑒定。乳酸菌生長繁殖時(shí)需要多種氨基酸，維生素及微氧，一般菌落比較小。分離培養(yǎng)基一般可添加西紅柿酵母膏油酸吐溫等物質(zhì)，均具有促進(jìn)生長作用。也常常添加醋酸鹽抑制有些細(xì)菌的生長，對(duì)乳酸菌無害?！∫?篩選方法：1.溶鈣圈法：利用一些產(chǎn)酸類細(xì)菌在含CaCO3的培養(yǎng)基上產(chǎn)生CaCO3溶解圈，從而篩選出這些產(chǎn)酸類細(xì)菌，可用于乳酸菌的篩選。其中培養(yǎng)基中加入CaCO3的作用是：①鑒別能產(chǎn)生酸的細(xì)菌；②中和產(chǎn)生的酸，以維持培養(yǎng)基的PH。篩選過程：樣品預(yù)處理→梯度稀釋至10-6→選擇合適的稀釋度涂布→37℃培養(yǎng)....48h→挑選產(chǎn)生溶鈣圈的菌落反復(fù)在MRS培養(yǎng)基上劃線→挑起單菌落

4、染色，經(jīng)鏡檢確認(rèn)為純種→挑選革蘭氏陽性單菌落→試管穿刺4℃冰箱保存。2.溴甲酚綠指示劑法：培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基（含溴甲酚綠酒精溶液）篩選過程：同上，不同之處是稀釋涂布后長出菌落，挑取使溴甲酚綠變色的菌落。二.菌種的分離篩選1.培養(yǎng)基：★1.1麥芽汁碳酸鈣培養(yǎng)基：麥芽汁（10BX）1L預(yù)先滅菌碳酸鈣5-10g/LPH自然（分離用）★★1.2牛肉膏10g/L蛋白胨10g/L酵母膏10g/L番茄汁200g/L葡萄糖10g/L吐溫0.05%CaCO315-20g/L溴甲酚綠0.01%PH6.0-6.5（分離用）★1.3番茄汁碳酸鈣培養(yǎng)基：酵母膏7.5g/L葡萄糖10g/L番茄汁100

5、mL蛋白胨7.5g/LKH2PO42.0g/L吐溫0.5mLPH6.0-6.5（分離用）1.4葡萄糖20g/L酵母膏10g/LPH6.0-6.51.5蛋白胨8-10g/L酵母膏3-5g/L葡萄糖13-15g/LKH2PO41.5-2.0g/LMgSO40.3-0.5g/LMnSO40.2-0.25g/LNaAC3.0-5.0g/LPH5.5-6.51.6蛋白胨0.8-1.0g/L糖蜜3.0-5.0g/L酵母膏3-5g/L玉米漿0.5-1.0g/LKH2PO40.1-0.3g/LMgSO40.3-0.5g/LNaC13-5g/L葡萄糖8-10g/LPH5.5-6.5（發(fā)酵或種子

6、培養(yǎng)基）★★1.7MRS培養(yǎng)基（分離培養(yǎng)計(jì)數(shù)用）蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、檸檬酸氫二銨2.0g、葡萄糖20.0g、吐溫801.0mL、乙酸鈉5.0g、磷酸氫二鉀2.0g、硫酸鎂0.58g、硫酸錳0.25g、瓊脂18.0g、蒸餾水1L,pH6.5。（分離培養(yǎng)基），當(dāng)MRS培養(yǎng)基冷卻至45～50℃時(shí),加入已滅菌的碳酸鈣,充分混勻,倒平板。1.8BCP培養(yǎng)基（溴甲酚紫培養(yǎng)基）乳糖5.0g蛋白胨5.0g酵母膏3.0g0.5℅溴甲酚紫10ml自來水1000mlpH6.5-7.0（分離用）1.9BCG牛乳營養(yǎng)瓊脂：脫脂奶粉10g，溶于50ml水中，加入1.6℅溴

7、甲酚綠酒....精溶液0.07ml，0.075Mpa20min。另取瓊脂2.0g，溶于50ml水中，加酵母膏1.0g溶解后調(diào)pH6.5-6.8，0.1Mpa20min.趁熱在無菌操作下兩者混合均勻，倒平板，37℃培養(yǎng)24h，檢查是否有雜菌。2.分離篩選：2.1富集培養(yǎng)：取1.0g（1.0ml）于無菌細(xì)口瓶中，加入無菌麥芽汁液體培養(yǎng)液于瓶口處，密閉，25-32℃培養(yǎng)48h。若培養(yǎng)基表內(nèi)出現(xiàn)絹絲波紋物，鏡檢桿狀，革蘭氏陽性，初步定為乳酸菌。以同樣方法轉(zhuǎn)接2-3次，接種量3-5℅.2.2菌種分離純化：溶鈣圈法