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1、高效液相色譜熒光紫外法測(cè)定動(dòng)物肌肉組織中多類藥物殘留論文李存江海洋吳銀良王戰(zhàn)輝趙思俊【摘要】建立了同時(shí)檢測(cè)動(dòng)物肌肉組織中9種喹諾酮類藥物、7種磺胺類藥物和甲氧芐啶的高效液相色譜檢測(cè)方法。動(dòng)物肌肉組織樣品用磷酸鹽緩沖液提取，HLB固相萃取柱凈化，洗脫液用氮?dú)獯抵两?，磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，以甲酸水溶液乙腈體系為流動(dòng)相，梯度洗脫，熒光紫外檢測(cè)器串聯(lián)測(cè)定。本方法的線性良好，相關(guān)系數(shù)r0.9987;平均回收率為70.6%～103.4%.freelides，SAs)都屬于人工合成的抗菌藥物，因其抗菌譜廣而廣泛用于預(yù)防和治療食品動(dòng)物的多種感染性疾病。甲氧芐啶(trimethoprim，TMP)作為一種
2、抗菌增效劑，可以增強(qiáng)QNs和SAs的抗菌作用，常與其配合使用1。這些藥物在獸醫(yī)臨床廣泛和大量的使用必然會(huì)導(dǎo)致其在動(dòng)物性食品中的殘留，嚴(yán)重危害人類的健康。我國(guó)和歐盟都已制定了多種QNs和SAs在動(dòng)物組織中的最高殘留限量2,3。QNs或SAs在動(dòng)物組織中與高效液相色譜(HPLC)串聯(lián)的檢測(cè)方法主要有紫外法(UV)4～7、熒光法(FLU)8,9和質(zhì)譜法(MS)10～12。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中，檢測(cè)豬和雞組織中QNs殘留的HPLC方法的檢出限為20μg/kg13，SAs殘留的HPLC方法的檢出限為10～20μg/kg14。為提高檢測(cè)效率，多類(multiclass)殘留檢測(cè),即一個(gè)方法可以同時(shí)檢測(cè)兩類以上的藥
3、物，已成為發(fā)展趨勢(shì)15～17。但有些方法靈敏度較差17，或儀器價(jià)格昂貴不易推廣應(yīng)用16，或檢測(cè)藥物較少15,17，而且不能同時(shí)測(cè)定TMP15～17，甚至在提取和凈化中使用大量的毒性高的有機(jī)溶劑，如使用氯制劑5,7,9。本研究建立了同時(shí)檢測(cè)動(dòng)物肌肉組織中9種QNs、7種SAs和TMP的HPLC檢測(cè)方法。組織樣品用磷酸鹽緩沖液提取，固相萃取柱凈化，方法簡(jiǎn)便、通用性強(qiáng)、有機(jī)溶劑用量少。2實(shí)驗(yàn)部分2.1儀器與試劑RP18(150mm×3.9mm，i.d.，5μm，美國(guó)P用UV檢測(cè)器檢測(cè)。3結(jié)果與討論3.1色譜條件的選擇由于結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)的差異，同時(shí)檢測(cè)和分離兩類以上結(jié)構(gòu)不同藥物對(duì)色譜條件要求較高。本研
4、究分別對(duì)多種型號(hào)和規(guī)格的色譜柱進(jìn)行考察和比較，采用SymmetryShildTMRP18色譜柱可成功分離QNs、SAs和TMP。QNs和SAs均為兩性化合物，流動(dòng)相酸度對(duì)其分離影響很大，而且QNs在酸性溶液中有較強(qiáng)熒光發(fā)射18。本實(shí)驗(yàn)采用甲酸水溶液乙腈體系為流動(dòng)相，對(duì)不同濃度甲酸的分離效果進(jìn)行了比較，降低甲酸的濃度會(huì)導(dǎo)致QNs的色譜峰拖尾，而且3類藥物不能完全分離，最終選擇0.1%甲酸乙腈體系作為流動(dòng)相。通常，SAs和TMP使用UV檢測(cè)器，而QNs常使用FLU檢測(cè)器，且不同的QNs的熒光光譜又相差較大。本實(shí)驗(yàn)采用常規(guī)的UV檢測(cè)器串聯(lián)程序波長(zhǎng)FLU檢測(cè)器測(cè)定樣品，一次進(jìn)樣可以同時(shí)檢測(cè)3類藥物
5、，而且都能獲得較高的靈敏度。程序FLU檢測(cè)波長(zhǎng)見2.2項(xiàng)。FLU和UV檢測(cè)器各藥物的色譜峰尖銳、對(duì)稱(見圖1)。圖1標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖(a,d,g,j);豬肉添加色譜圖(b,e);空白豬肉色譜圖(c,f);雞肉添加色譜圖(h,k);空白雞肉色譜圖(i,.freel)1.甲氧芐啶(trimethoprim);2.麻保沙星(marbofloxacin);3.磺胺嘧啶(sulfadiazine);4.氧氟沙星(ofloxacin);5.磺胺吡啶(sulfapyridine);6.磺胺噻唑(sulfathiazole);7.環(huán)丙沙星(ciprofloxacin);8.洛美沙星(lomefloxacin);9
6、.單諾沙星(danofloxacin);10.恩諾沙星(enrofloxacin);11.磺胺二甲基嘧啶(sulfamethazine);12.沙拉沙星(sarafloxacin);13.磺胺間甲氧嘧啶(sulfamonomethoxine);14.磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole);15.惡喹酸(oxolinicacid);16.磺胺苯酰(bensoylsulfanilamide);17.氟甲喹(flumequine)。3.2樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化本研究試圖減少毒性大的有機(jī)溶劑在提取和凈化中的使用，磷酸鹽緩沖液可以有效提取(氟)喹諾酮類藥物8,19，但磷酸鹽緩沖液提取組織樣品中SA
7、s的方法報(bào)道很少15。本研究考察了不同組成、不同濃度、不同pH值的多種磷酸鹽緩沖液的提取效果，最后確定采用K2HPO4KH2PO4緩沖液(pH=6.0)同時(shí)提取豬和雞肌肉中的QNs,SAs和TMP，并對(duì)提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，取得了滿意的回收率，結(jié)果見表1。多類藥物的殘留分析方法常采用較復(fù)雜的前處理過程，本研究對(duì)多種固相萃取柱進(jìn)行比較，最后采用單個(gè)HLB固相萃取柱同時(shí)凈化QNs,SAs和TMP，獲得
