高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬肉中泰拉霉素殘留論文

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1、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬肉中泰拉霉素殘留論文劉勇軍,吳銀良姜艷彬沈建忠【摘要】建立了高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLCMS/MS)測定豬肉樣品中新型獸藥泰拉霉素殘留的方法。樣品用V(甲醇)∶V(0.1%H3PO4)=70∶30混合溶液提取，經(jīng)離心后用PCX固相萃取小柱凈化,以SymmetryC8色譜柱為分離柱，在串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式下檢測，內(nèi)標(biāo)法定量。方法的線性范圍為10～500μg/kg，檢出限為5.0μg/kg，在3個(gè)濃度水平(10，20和50μg/kg)進(jìn)行添加實(shí)驗(yàn)，平均回收率為9

2、3.1%～105.5%;批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～4.6%;批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%～5.6%?！娟P(guān)鍵詞】高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜.freelycin)是一種新近上市且為動(dòng)物專用的大環(huán)內(nèi)酯類半合成抗生素，分子式為C41H79N3O12(分子量806)，其分子結(jié)構(gòu)如圖1所示。我國農(nóng)業(yè)部在2008年第957號(hào)公告中首次批準(zhǔn)使用泰拉霉素。泰拉霉素主要用于放線桿菌、支原體、巴氏桿菌、副嗜血桿菌引起的豬、牛的呼吸系統(tǒng)疾病。具有用量少、一次給藥、低殘留、動(dòng)物專用等優(yōu)點(diǎn)1,2。我國廣泛使用的大環(huán)內(nèi)酯類藥物為泰樂菌素和替

3、米考星，雖然這兩種藥物的使用效果良好，但隨著使用時(shí)間的延長，圖1泰拉霉素分子結(jié)構(gòu)式Fig.1Structureoftulathromycin在很多地區(qū)出現(xiàn)了不同程度的耐藥性3，而泰拉霉素藥效強(qiáng)于泰樂菌素、替米考星和氟苯尼考等市場廣泛使用的大環(huán)內(nèi)酯類藥物，因此，泰拉霉素必將在畜禽生產(chǎn)中大量使用。作為一種新藥，泰拉霉素的殘留檢測方法的研究尤為必要。目前，大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留檢測方法有ELISA篩選法4、薄層色譜法5、氣質(zhì)聯(lián)用法6、高效液相色譜7～10和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等11，12。有關(guān)泰拉霉素的殘留檢測研究

4、較少13。本研究建立了以羅紅霉素(C41H76N2O15,837)為內(nèi)標(biāo)的泰拉霉素的HPLCMS/MS檢測方法，方法的定量限為10μg/kg，可以滿足有關(guān)法規(guī)對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的檢測要求，為動(dòng)物組織中泰拉霉素的殘留監(jiān)控提供技術(shù)支持。2實(shí)驗(yàn)部分2.1儀器與試劑icroTMAPI高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國S1Minishaker旋渦混合器;EEVAP水浴氮?dú)獯蹈蓛x(美國Organomation公司);超純水器(美國MilliQ公司)。泰拉霉素標(biāo)準(zhǔn)品與羅紅霉素內(nèi)標(biāo)(Sigma公司)、乙腈、甲醇、H3PO4為

5、色譜純;甲酸、KH2PO4、NH3·H2O為分析純;實(shí)驗(yàn)室用水為MilliQ高純水。2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制泰拉霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取泰拉霉素10.0mg，用V(0.05mol/LK2HPO4)∶V(乙腈)=75∶25(pH6.0)定容至10mL，搖勻，置冰箱冷藏儲(chǔ)存，有效期3個(gè)月。內(nèi)標(biāo)物羅紅霉素的配制方法同泰拉霉素。添加溶液的配制：吸取儲(chǔ)備液1mL于100mL容量瓶中并用V(0.05mol/LK2HPO4)∶V(乙腈)=75∶25(pH6.0)混合液定容，再從中吸取1mL于50mL容量瓶中得添加液濃度為0

6、.2mg/L(冰箱冷藏儲(chǔ)存，有效期2個(gè)月)。2.3內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的確定由于大環(huán)內(nèi)酯類藥物的同位素內(nèi)標(biāo)物質(zhì)很少,至今無泰拉霉素同位素內(nèi)標(biāo)物出售。而測定大環(huán)內(nèi)酯類藥物的檢測方法研究和標(biāo)準(zhǔn)修制訂一般采用外標(biāo)法或者采用大環(huán)內(nèi)酯類某種結(jié)構(gòu)相似藥物作為內(nèi)標(biāo)物來進(jìn)行定量分析。本實(shí)驗(yàn)選用一種沒有用于獸藥用途且結(jié)構(gòu)與泰拉霉素非常相似的大環(huán)內(nèi)酯類藥物羅紅霉素作為內(nèi)標(biāo),分子結(jié)構(gòu)如圖2所示。圖2內(nèi)標(biāo)物羅紅霉素分子結(jié)構(gòu)式Fig.2Structureofroxithromycinasinternalstandard2.4供試樣品溶液的制備稱

7、取2.0g組織樣品于50mL聚四氟乙烯塑料管中，加入10mL提取液(V(甲醇)∶V(0.1%H3PO4)=70∶30)和適量內(nèi)標(biāo)工作液，7800r/min勻質(zhì)1min后，5000r/min離心2min，收集上清液過已經(jīng)分別用3mL甲醇和3mL提取液潤洗過的60g/3L的PCX小柱，待全部過柱后，再用3mL水、3mL甲醇淋洗，最后用4mL4%氨化甲醇洗脫，50℃水浴氮?dú)獯蹈珊笥?mL流動(dòng)相定容，進(jìn)行HPLCMS/MS分析。2.5LCMS/MS分析條件SymmetryC8柱(20mm×3.9mm，5μm)

8、，流動(dòng)相：V(乙腈)∶V(0.1%甲酸水溶液)=70∶30;柱溫：30℃，進(jìn)樣室溫度15℃，進(jìn)樣量：10μL，流速為0.3mL/min。ESI(+);多級(jí)反應(yīng)檢測(MRM);毛細(xì)管電壓：4.2kV;錐孔電壓：20V;RF透鏡電壓：0.2V;離子源溫度：110℃;脫溶劑氣溫度：350℃;錐孔氣流速：50L/h;脫溶劑氣流速：600L/h;倍增器電壓：650V;二級(jí)碰撞氣：氬氣。3結(jié)果與討論3.1樣品的提取和凈化泰拉