阿倫膦酸鈉對骨髓生成破骨細胞骨吸收作用的影響

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1、阿倫膦酸鈉對骨髓生成破骨細胞骨吸收作用的影響作者：陳明，鄭瓊，方真華，勘武生【摘要】［目的］研究阿倫膦酸鈉對體外培養(yǎng)的小鼠骨髓生成破骨細胞及其骨吸收作用的影響。［方法］收集小鼠骨髓細胞于含有10-8mol／L的1，25二羥基維生素D3［1,25-(OH)2D3］的α-MEM完全培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)，設置不同濃度的阿倫膦酸鈉給藥，并于培養(yǎng)的第6、9、12d觀察記錄抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistantacidphosphatase,TRAP)陽性多核巨細胞［破骨樣細胞(osteoclast-likecell,OLC)］生

2、成數(shù)，反映破骨細胞生成情況。記數(shù)培養(yǎng)12d骨磨片上骨吸收陷窩數(shù)及吸收面積，反映骨吸收情況。［結果］隨著阿倫膦酸鈉濃度的增高，TRAP陽性的細胞數(shù)減少，骨吸收陷窩數(shù)及面積均減少。［結論］阿倫膦酸鈉可抑制骨髓細胞體外培養(yǎng)中破骨樣細胞的形成，體外可抑制破骨細胞骨吸收作用?！娟P鍵詞】阿倫膦酸鈉；骨髓細胞；破骨細胞；骨吸收Abstract：［Objective］Tostudytheeffectofalendronateonboneresorptionandosteoclast-likecellsformationinmousebonemarr

3、okunmingmouseol/L［1,25-(OH)2D3］.TRAPpositivecellsationofosteoclast-likecells.Thenumberofboneresorptionpitsandareaonboneslicesberofboneresorptionpitsandareaarroarroa)，α-MEM培養(yǎng)基(Sigma);胎牛血清(Gibco)；(萘酚AS-BI磷酸鈉，六偶氮副品紅，酒石酸鉀鈉)自配；阿倫膦酸鈉由默沙東公司提供，薄骨片自行制備。TRAP孵育液的配制：孵育液A液，0.2mol／L

4、醋酸緩沖液，pH5.0；B液，六偶氮副品紅，取副品紅1g加去離子水20ml，濃鹽酸5ml，加熱至90℃過濾制成副品紅溶液，置于黑色瓶4℃儲存，臨用前與4％亞硝酸鈉等比例混合；C液，取萘酚AS-BI磷酸鹽20mg加入N-二甲基甲酰胺1ml溶解。取A液18ml、B液1ml、C液1ml混勻，用1mol／L氫氧化鈉或鹽酸調(diào)pH至5.0，加入酒石酸鉀鈉282mg配成TRAP孵育液，過濾備用。薄骨片的制備：將新鮮牛股骨的皮質(zhì)骨用鋼鋸及粗細金剛砂石制備成6mm×6mm大小，30μm厚的骨磨片，骨蒸餾水中在超聲波清洗儀內(nèi)清洗3次，每次10min。紫

5、外線照射消毒，然后將骨片浸泡于α-MEM培養(yǎng)液內(nèi)(含青霉素1000u／ml，鏈霉素1000μg／ml)，換液3次，每次20min。1.2骨髓細胞的收集培養(yǎng)參照1.6統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差x±s表示，結果采用方差分析q檢驗，檢測不同處理組之間TRAP染色陽性細胞數(shù)、骨吸收陷窩數(shù)及面積差異有無統(tǒng)計學意義。2結果培養(yǎng)6d后對照組玻片上開始出現(xiàn)數(shù)目不等的多核巨細胞，相差顯微鏡下細胞形態(tài)清晰，呈油煎蛋形、長條形、漏斗形或不規(guī)則形，有片狀或絲狀偽足，這些細胞胞漿豐富，有幾個到十幾個細胞核，胞漿內(nèi)可見大小不等的空泡，細胞形態(tài)會隨著培養(yǎng)

6、時間延長而變化。TRAP染色胞漿顆粒呈紫紅色，經(jīng)鑒定為破骨細胞(圖1～3)。培養(yǎng)6d10-4mol／L組未見明顯破骨樣細胞，10-5mol／L和10-6mol／L組可見很少的破骨樣細胞出現(xiàn)。第9、12d玻片TRAP染色均可見數(shù)目不等的TRAP陽性細胞，但對照組OLC細胞遠多于各實驗組，且隨著阿倫膦酸鈉濃度的增高，TRAP染色陽性細胞呈遞減趨勢(表1)，兩兩比較顯示，3個實驗組TRAP陽性細胞數(shù)均明顯少于實驗組(P<0.01)，說明阿倫膦酸鈉具有抑制骨髓生成破骨細胞的作用。表1不同階段各組TRAP染色陽性細胞記數(shù)注：*對照組比，

7、P<0．01，△與10-6mol/L組比，P<0.05掃描電鏡觀察破骨細胞形態(tài)多樣，與相差倒置顯微鏡所見一致，可見大而扁平的薄紗樣偽足，細胞表面大量絲狀突起。骨吸收陷窩呈圓形、橢圓形，底面粗糙，邊界清晰(圖4)。細胞培養(yǎng)12d骨片吸收陷窩數(shù)與面積測量結果(表2)，不同濃度的阿倫膦酸鈉均明顯抑制破骨細胞對骨磨片的骨吸收。表2阿倫膦酸鈉對骨吸收陷窩與面積的影響注：*與對照組比，P<0.01圖1～3體外培養(yǎng)6d，小鼠骨髓經(jīng)1，25-（ＯＨ）２Ｄ３誘導生成破骨細胞，TRAP、HE染色鑒定及倒置相差顯微鏡下顯示破骨細胞形態(tài)多

8、樣，胞漿豐富，有較多偽足200×圖4掃描電鏡下觀察到骨片吸收陷窩1500×3討論3.1破骨細胞培養(yǎng)與鑒定破骨細胞由于數(shù)量少，體積大，含豐富蛋白水解酶并且有緊貼骨基質(zhì)生長等特點，使得分離中破骨細胞易受損傷，獲得較純前破骨細胞難度較大，尤